與流行的CRISPR-Cas9系統(tǒng)（如圖）相比，一種名為prime editing的新基因編輯工具可以提供更高的精度和對DNA編輯的控制（如圖）。圖片來源：Juan Gaertner / SPL

CRISPR–Cas9基因編輯工具備受關(guān)注，雖然這種技術(shù)可以輕松地改變基因組，但它仍然有時(shí)容易出錯(cuò)，或者產(chǎn)生意想不到的影響。現(xiàn)在，最近開發(fā)的替代方法可以更好地控制基因組編輯，這對于開發(fā)基因療法可能尤其重要。

Broad研究所劉如謙（David R. Liu）教授在10月21日Nature雜志發(fā)表題為“Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA”的研究論文，開發(fā)了一種全新的精準(zhǔn)基因編輯工具——先導(dǎo)編輯（Prime Editor），這種方法融合了工程逆轉(zhuǎn)錄酶和Cas9，將新的遺傳信息直接寫入到靶向DNA位點(diǎn)，從而使用Prime編輯導(dǎo)向RNA進(jìn)行編輯。

作者表示，這種方法可以降低“脫靶”效應(yīng)，這是標(biāo)準(zhǔn)CRISPR–Cas9系統(tǒng)某些應(yīng)用面臨的主要挑戰(zhàn)，從而帶來更安全的基因療法。

目前，DSBs刺激的同源性定向修復(fù)（HDR）已被廣泛用于精確的DNA編輯。但是，HDR依賴于外源供體DNA修復(fù)模板，通常會通過DSB的末端修復(fù)產(chǎn)生過量的indel，并且在大多數(shù)治療相關(guān)的細(xì)胞類型（T細(xì)胞和某些干細(xì)胞是重要的例外）中效率低下。雖然提高DSB介導(dǎo)的編輯的效率和精度仍然是有前途的工作的重點(diǎn)，但這些挑戰(zhàn)促使人們探索替代的精確基因組編輯策略。

2016年，David Liu實(shí)驗(yàn)室等處開始了不依賴于DNA鏈斷裂的基因編輯技術(shù)的研究，其實(shí)“不依賴于DNA鏈斷裂的基因編輯技術(shù)”就是單堿基基因編輯技術(shù)。David Liu實(shí)驗(yàn)室基于的是胞嘧啶脫氨酶APOBEC1（能催化C脫氨基變成U，而U在DNA復(fù)制過程中會被識別成T）和尿嘧啶糖基化酶抑制劑UGI（能防止尿嘧啶糖基化酶將U糖基化引起堿基切除修復(fù)）開發(fā)了第二代和第三代單堿基編輯系統(tǒng)APOBEC-XTEN-dCas9-UGI （BE2）和APOBEC-XTEN-Cas9n-UGI（BE3）。

堿基編輯可以有效地進(jìn)行四個(gè)堿基轉(zhuǎn)換突變（C→T，G→A，A→G和T→C），而無需在包括哺乳動(dòng)物在內(nèi)的許多細(xì)胞類型和生物體中使用DSB，但目前無法執(zhí)行八個(gè)轉(zhuǎn)換突變 （C→A，C→G，G→C，G→T，A→C，A→T，T→A和T→G），例如需要從T→A到A→T突變直接糾正鐮狀細(xì)胞?。℉BB E6V）的最常見原因。 此外，尚無報(bào)道采用無DSB的方法進(jìn)行靶向缺失，如去除引起Tay-Sachs?。℉EXA 1278 + TATC）的4堿基重復(fù)，或靶向插入，如需要直接插入3個(gè)堿基來糾正最常見的囊性纖維化病因（CFTRΔF508）。

為此，David Liu等人將思路轉(zhuǎn)變了一下，設(shè)計(jì)了一種特殊的gRNA，也就是pegRNA。與普通的gRNA不同，這種pegRNA不但能夠結(jié)合想要進(jìn)行編輯的特定DNA區(qū)域，還自帶“修改模板”。Cas9-逆轉(zhuǎn)錄酶融合蛋白會在pegRNA的引導(dǎo)下，精準(zhǔn)地切開一條DNA鏈，然后根據(jù)“修改模板”，合成含有正確序列的DNA。細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制會自動(dòng)把這段新合成的序列整合進(jìn)基因組。

研究人員在早期測試中取得了相當(dāng)大的成功。正如他們在論文中所寫的那樣，他們“在人類細(xì)胞中完成了超過175次編輯，包括目標(biāo)插入，缺失和所有12種類型的點(diǎn)突變，而無需雙鏈斷裂或供體DNA模板?！?/p>

研究顯示了4種人類細(xì)胞系，以及有絲分裂后的小鼠皮層神經(jīng)元原神經(jīng)“以不同的效率證實(shí)了prime editing?！薄拔覀冞€沒有在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)其它能像是這種具有多功能性和精確度的技術(shù)，”David Liu等幾位相關(guān)科學(xué)家對研究發(fā)表了聲明。

文章第一作者Andrew Anzalone說：“隨著我們開發(fā)的這項(xiàng)技術(shù)越來越多的應(yīng)用，這項(xiàng)技術(shù)的多功能性很快受到矚目?！?“我們可以將新的遺傳信息直接復(fù)制到靶標(biāo)位點(diǎn)，我們真的很興奮?！?/p>

Nature雜志評論這一技術(shù)是“超精確的新型基因編輯工具”，Science 雜志評論它是“超越CRISPR”的重大突破，哈佛大學(xué)教授George Church盛贊這一成果：“朝著正確方向邁出的一大步”。

來源：生物通

原文標(biāo)題：

A. Anzalone et al., “Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA,” Nature, doi:10.1038/s41586-019-1711-4, 2019.

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