北京時間2月26日，Science以Research Article形式在線發(fā)表了中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心（生物化學與細胞生物學研究所）研究員周斌研究組的研究成果Proliferation tracing reveals regional hepatocyte generation in liver homeostasis and repair。該研究首次開發(fā)出能夠長時程示蹤體內細胞增殖的新技術，利用該技術研究人員發(fā)現了成體肝細胞的來源，為肝臟再生及疾病臨床治療研究提供了新思路。

　　細胞增殖是多細胞生物體在發(fā)育、生理穩(wěn)態(tài)和組織再生中的基本生物學過程，細胞增殖過多或受阻是較多疾病的致病基礎。檢測細胞的增殖能力對于發(fā)育生物學、腫瘤學、神經科學和再生醫(yī)學等學科的研究十分重要。目前，檢測細胞增殖的方法主要有兩種：基于細胞增殖標記物（如Ki67、pH-H3等）的組織化學染色；核苷酸類似物（如BrdU、EdU等）的摻入。然而，上述檢測方法均存在一定的局限性：在時間上，檢測的是某個時間點而非某個時間段內的細胞增殖，就像照相機，只能拍攝某一瞬間的細胞增殖信號，這對于一些增殖能力較低的細胞如心肌細胞、神經元等較難檢測到；在空間上，所有類型的增殖細胞都會被無差別的檢測，容易造成非目的細胞增殖信號的干擾，信噪比低、分辨率差。因此，開發(fā)一種有效檢測體內細胞增殖的新技術，實現長時間不間斷、組織特異性地標記細胞增殖尤為重要。

　　周斌研究組長期致力于新型遺傳譜系示蹤技術的開發(fā)與應用。研究中，科研人員建立了一種檢測細胞增殖的新技術——ProTracer（Proliferation Tracer）。作為一種遺傳學技術，ProTracer突破了傳統(tǒng)檢測細胞增殖方法的思維模式，利用廣泛使用的細胞增殖標記物Ki67，在課題組前期開發(fā)的Dre-rox和Cre-loxP的雙同源重組酶介導的遺傳譜系示蹤技術的（He et al., Nature Medicine 2017）基礎上，利用Dre-rox啟動Cre同源重酶介導的細胞增殖示蹤系統(tǒng)進行遺傳標記。ProTracer猶如一臺錄像機，一旦啟動便可實現在數月甚至數年內不間斷地記錄細胞增殖，這對于檢測增殖能力較低的細胞以及評估細胞增殖能力的動態(tài)變化過程十分有益。同時，ProTracer可以實現直接檢測某一特定譜系細胞增殖情況，避免其他類型細胞增殖信號的干擾，提高了信噪比和分辨率，使檢測信號更直觀，能夠實現從器官整體水平上觀察細胞增殖。此外，ProTracer能夠實現活體檢測細胞增殖，可以在不犧牲動物的情況下，直接在同一個動物上多時間點檢測體內細胞增殖，觀察細胞增殖的動態(tài)變化過程。ProTracer可廣泛應用于不同組織器官細胞增殖的檢測，為發(fā)育生物學、腫瘤學、神經科學和再生醫(yī)學等研究領域提供技術支撐。

　　周斌研究組利用ProTracer研究了在成體肝臟生理穩(wěn)態(tài)和損傷再生過程中肝細胞的來源。目前，在肝臟領域，這是一個亟待解決且具有爭議的重要科學問題。盡管在某些極其嚴重的肝損傷情況下，膽管細胞可以轉分化貢獻形成肝細胞，但在肝臟生理穩(wěn)態(tài)和損傷再生過程中的肝細胞的更新主要依賴原有肝細胞的自我增殖。肝臟的基本結構單位是肝小葉，肝小葉中的肝細胞由于代謝功能和基因表達等的不同具有較大的異質性，從肝門靜脈區(qū)到肝中央靜脈區(qū)大體可分為三區(qū)：門靜脈周圍肝細胞（E-CAD⁺，Zone 1）、中間區(qū)肝細胞（E-CAD^–GS^–，Zone 2）和中央靜脈周圍肝細胞（GS⁺，Zone 3）。 有研究認為，不同區(qū)域的肝細胞增殖能力顯著不同，但究竟哪些肝細胞亞群對新生肝細胞起主要貢獻仍存在較大爭議，目前主要有以下幾種理論：肝細胞流動理論（肝細胞由門靜脈側向中央靜脈側流動，Liver 1985）；中央靜脈周圍肝細胞理論（Axin2⁺肝細胞，Nature 2015）；門靜脈周圍肝細胞理論（Sox9⁺肝細胞，Cell 2015）；分散式理論（Tert^high肝細胞，Nature 2018）；廣泛分布式理論（肝細胞無差別增殖，Cell Stem Cell 2020）。以往研究均是依賴單個分子標記分析肝臟中某一肝細胞亞群的擴增能力，缺少對肝臟整體水平上對所有肝細胞增殖能力的分析。

　　周斌研究組突破此前的研究模式，即不再依賴單一分子標記追蹤某一肝細胞亞群的擴增情況，而是利用ProTracer技術去直接標記新生的肝細胞，不僅可以實現對所有肝細胞類群進行分析，而且可以直觀精準地展現出新生肝細胞的來源。研究人員采用廣譜性的ProTracer（所有類型細胞的增殖都能夠被檢測）在成體啟動細胞增殖的記錄，并在啟動后的多個不同時間點檢測肝細胞的增殖信號，結合E-CAD和GS等肝細胞分區(qū)標記基因免疫熒光共染色，發(fā)現在生理穩(wěn)態(tài)過程中肝細胞通過緩慢的增殖維持自我更新。新生的肝細胞并非來源于以往報道的任何一個類群，而是主要來源于肝小葉中的中間區(qū)域（E-CAD^–GS^–，Zone 2）。

　　為了排除非肝細胞增殖信號的干擾，研究人員在廣譜性ProTracer技術的基礎上，結合肝細胞特異性表達的基因Albumin（Alb）啟動子，開發(fā)了肝細胞特異性的ProTracer技術。肝細胞特異性的ProTracer僅標記肝細胞的增殖，能夠實現直接在肝臟器官整體水平上展現肝細胞增殖。

　　將肝細胞特異性ProTracer在成體啟動后，研究人員將肝臟的全標本進行了熒光拍照，發(fā)現被tdTomato紅色熒光標記的增殖的肝細胞呈現出一圈圈類似“甜甜圈”的形狀（圖A），說明肝細胞增殖具有區(qū)域偏好性，肝臟組織切片的免疫熒光染色結果進一步證實了增殖的肝細胞位于肝小葉的中間區(qū)域，即E-CAD^–GS^–的Zone 2（圖B）。此外，周斌組還開發(fā)了活體檢測肝細胞增殖的ProTracer技術，利用該技術研究人員檢測了同一個小鼠個體在多個不同時間點肝細胞的增殖及其動態(tài)變化過程，這也是首次實現活體檢測細胞增殖。

　　為了研究肝臟損傷再生過程中新生肝細胞的來源，研究人員利用ProTracer技術結合肝切、膽管結扎和CCl₄等多種肝損傷模型，發(fā)現在肝切模型中，位于Zone 1的肝細胞起始肝臟再生過程，而后Zone 2的肝細胞迅速增殖。而在膽管結扎和CCl₄急性損傷模型中，則是位于Zone 2的肝細胞起始肝臟再生過程。此外，研究人員利用廣譜性ProTracer系統(tǒng)地描繪了肝臟再生過程中其他類型細胞的增殖情況，如膽管上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞、巨噬細胞。

　　綜上，該研究開發(fā)出一種檢測細胞增殖的遺傳新技術——ProTracer，以全新的視角探究了成體肝細胞的來源，突破了傳統(tǒng)思維模式和技術局限性，直觀地展現了所有肝細胞類群的增殖情況，首次發(fā)現肝小葉中間區(qū)域（Zone 2）的肝細胞是成體肝臟在生理穩(wěn)態(tài)中新生肝細胞的主要細胞來源，并揭示了不同損傷再生模型中新生肝細胞的來源，準確回答了成體肝細胞來源這一重要科學問題。該研究為肝臟損傷修復再生研究開辟了新思路，為肝臟疾病的治療提供了新的理論基礎。

　　此外，新開發(fā)的ProTracer技術具有長時間不間斷檢測細胞增殖的能力，可以特異性地標記某種特定細胞譜系的細胞增殖，并實現了不犧牲樣品直接活體檢測細胞增殖，從多個維度刷新了細胞增殖檢測的能力和范圍，可以廣泛應用于不同組織器官細胞增殖的檢測，為發(fā)育生物學、腫瘤學、神經科學和再生醫(yī)學等研究領域提供技術支撐。

　　周斌研究組副研究員何靈娟、博士后蒲文娟、博士研究生劉秀秀為論文的共同第一作者，周斌為論文通訊作者。研究工作得到瑞士諾華醫(yī)學生物研究所教授Jan S. Tchorz、南京醫(yī)科大學教授季勇、瑞典阿斯利康制藥有限公司博士Qing-Dong Wang和上海南方模式生物公司博士孫瑞林及其團隊的支持。該工作受到分子細胞卓越中心動物平臺和細胞分析技術平臺的支持，并獲得中科院、國家自然科學基金委員會、科技部及上海市科學技術委員會等的支持。

　　論文鏈接

　?。ˋ）利用肝細胞特異性的ProTracer標記增殖肝細胞的成體小鼠肝臟。tdTomato⁺的增殖肝細胞呈現出一圈圈的類似“甜甜圈”的形狀。（B）利用ProTracer揭示成體肝臟中新生肝細胞（tdTomato⁺）主要來源于E-CAD^–GS^– Zone 2。E-CAD（綠色）；GS（青色）

來源：中科院