腫瘤是“機體內(nèi)某一局部組織細胞的過度增生”，很多人都知道它可以分為良性腫瘤和惡性腫瘤。

但腫瘤其實也分冷熱，學(xué)界將有免疫原性、會被自身免疫細胞攻擊的腫瘤稱為 “熱腫瘤”，而無免疫原性、容易逃避免疫系統(tǒng)攻擊的稱為 “冷腫瘤”。

其中，“冷腫瘤”在接受免疫治療后往往療效不佳，一直是醫(yī)生與患者頭痛的難題。

目前，腫瘤靶向治療已成為腫瘤研究中的熱點，通過對腫瘤特異性靶點的選擇性攻擊，可以在較少損害正常組織的情況下，針對性地對腫瘤細胞進行攻擊。

近年來，對于某些特定的腫瘤如 EGFR表達陽性的肺癌、Her2 表達陽性的乳腺癌，靶向治療方法的效果比較出色。

然而，有一些癌癥組織在受體表達上與正常組織相比并沒有明顯不同，甚至可以通過高表達正常組織具有的免疫信號分子來逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，比如三陰性乳腺癌。

許多能逃避免疫系統(tǒng)攻擊的腫瘤細胞表面，都具有 PD-1（程序性死亡受體1）蛋白的配體 PD-L1 蛋白，該蛋白也存在于抗原提呈細胞表面；而 PD-1 蛋白則位于活化的 T 細胞表面。PD-L1蛋白通過結(jié)合PD-1蛋白抑制 T 細胞的炎癥活動，削弱免疫系統(tǒng)對外來侵略的攻擊，并促進自身耐受。這避免了自身免疫性疾病的產(chǎn)生，但也導(dǎo)致了癌細胞的免疫逃逸。

打個比方，腫瘤細胞與 T 細胞好比在打諜戰(zhàn)，而 PD-1 與 PD-L1 是暗號，如果腫瘤細胞能在 T 細胞喊出 “PD-1”時對上暗號 “PD-L1” 來證明身份，T 細胞就不會攻擊。

基于腫瘤細胞的這種特性，針對 PD-1 和 PD-L1 的單克隆抗體，已廣泛應(yīng)用于臨床的抗腫瘤治療。

但對于不同類型的腫瘤，單抗藥物的臨床反應(yīng)率不僅不一致、而且普遍較低，甚至已有文獻認為目前的 PD-1 抗體治療，對于三陰性乳腺癌是無效的。此外，昂貴的價格，也給腫瘤患者們帶來巨大的經(jīng)濟負擔。

為克服 PD-1/PD-L1 抗體藥物的一系列不足之處，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院 / 良渚實驗室的夏宏光團隊在最新研究中，篩選了一系列調(diào)控PD-L1蛋白水平下降的先導(dǎo)化合物，并闡明了 PD-L1 蛋白新的降解機制。

他們發(fā)現(xiàn)，ARIH1（Ariadne RBR E3 Ubiquitin Protein Ligase 1），是負責(zé)靶降解 PD-L1 的 E3 泛素連接酶。

他們還發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞會通過 EGFR-GSK3α-ARIH1 信號傳導(dǎo)來逃避免疫系統(tǒng)攻擊的機制，并提示 ARIH1 是腫瘤免疫治療新的潛在藥物靶點。

4 月 20 日，相關(guān)論文以標題 ARIH1 signaling promotes anti-tumor immunity by targeting PD-L1 for proteasomal degradation 發(fā)表于 Nature Communications。

圖 | 相關(guān)論文（來源：受訪者）

高通量篩選確定促進 PD-L1 降解的先導(dǎo)化合物

該團隊對 2125 種 FDA 批準的藥物及候選藥物進行高通量篩選之后，鑒定了 一系列促進PD-L1 降解的先導(dǎo)化合物。

為了建立一個基于熒光的測定內(nèi)源性 PD-L1 膜蛋白水平的高通量篩選模型，夏宏光使用了與藻紅蛋白（P-phycoerythrin,PE）結(jié)合的 PD-L1 抗體和干擾素 -γ（IFNγ）處理的 U937 細胞（組織細胞性淋巴肉瘤細胞系）。

其中，干擾素 -γ 增強了 PD-L1 的基礎(chǔ)表達水平，使得后者的動態(tài)范圍更廣，因而其結(jié)果也更具精確性與說服力。

該團隊還發(fā)現(xiàn)，在這些 FDA 批準的藥物及候選藥物中，共有 160 種藥物可以降低 PD-L1 膜蛋白水平。

隨后，夏宏光根據(jù)這些先導(dǎo)化合物參與的信號通路，對陽性藥物進行分類，其中包括 JAK/STAT 通路（The Janus kinase/signal transducer and activator of tran-ions）抑制劑、磷脂酰肌醇 3 – 激酶（PI3K）/蛋白激酶 B/mTOR 通路抑制劑、細胞周期調(diào)節(jié)激酶抑制劑等，這些都是已知的能對PD-L1膜蛋白水平發(fā)揮調(diào)控功能的通路抑制劑。

鎖定研究對象 ——靶向藥物 ES-072

已有大量研究表明，表皮生長因子受體信號通路可激發(fā) PD-L1 表達，并引起腫瘤細胞的免疫逃逸。篩選獲得的靶向藥物 ES-072 也是表皮生長因子受體抑制劑，是夏宏光參與開發(fā)的靶向新藥，夏宏光將它定為研究對象。

為探索靶向藥物 ES-072 誘導(dǎo) PD-L1 降解的背后機制，該團隊測試了ES-072 處理后PD-L1是否會發(fā)生磷酸化變化，并通過生物質(zhì)譜等實驗證實了 PD-L1 的降解取決于其胞內(nèi)段 Ser279 和 Ser283 這兩個位點的磷酸化。

由于表皮生長因子受體活性喪失會導(dǎo)致蛋白激酶 B 活性下降，而蛋白激酶 B可同時調(diào)控糖原合成激酶 – GSK3α 與 GSK3β。

為搞清楚到底誰起了主要作用，他們進行了大量實驗，并利用生物質(zhì)譜等技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一系列與 PD-L1 相互作用的激酶蛋白。

其中，ES-072 處理后，GSK3α 與 PD-L1 膜蛋白的相互作用，顯著增強（見下圖）。

體外磷酸化等并行實驗也證明，表皮生長因子受體抑制劑誘導(dǎo)的 PD-L1 Ser279/283 位點磷酸化是由 GSK3α介導(dǎo)的。

E3 泛素連接酶登上舞臺

在理清楚這條通路后，夏宏光又提出了新問題 —— 在使用靶向藥物 ES-072 治療后，究竟是哪個 E3 泛素連接酶促進了 PD-L1 的泛素化和降解呢？

在分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)后，他發(fā)現(xiàn)除了已知的介導(dǎo) PD-L1 降解的 Cullin 連接酶外，靶向藥物 ES-072 還促進了 PD-L1 與名為 ARIH1 的 E3 泛素鏈接酶的相互作用。同時他還發(fā)現(xiàn)，ARIH1 的瞬時過表達，可促進 PD-L1 的 K48 相關(guān)泛素化增強。

此外，ARIH1 在人肺腺癌細胞H1975和人胚胎腎細胞 293 中高表達，可“劑量依賴”地促進內(nèi)源性 PD-L1 降解，而 ARIH1 敲除則導(dǎo)致內(nèi)源性 PD-L1 水平增加。一系列實驗結(jié)果表明，ARIH1 能直接泛素化 PD-L1，并介導(dǎo)其通過蛋白酶體降解。

接下來，夏宏光測試了 GSK3α介導(dǎo)的 PD-L1 在 Ser279/283 位點的磷酸化是否促進了 PD-L1 招募 ARIH1。

他和團隊將穩(wěn)定表達 ARIH1的人胚胎腎細胞 293，轉(zhuǎn)染上野生型 PD-L1 或耐磷酸化的 S279A、S283A、2SA（S279A 和 S283A 兩個位點的合稱）突變體。

結(jié)果顯示，在 S279A 和 S283A 突變的細胞中，ARIH1 高表達誘導(dǎo)的 PD-L1 泛素化大量減少，與此一致的是，ARIH1 與 PD-L1 的相互作用也因 2SA 突變而顯著降低。

靶向藥物 ES-072 的處理，增強了 ARIH1 和野生型 PD-L1 之間的相互作用，但沒有增強其和 PD-L1 2SA 突變體的相互作用，而 GSK3α 高表達誘導(dǎo)的 PD-L1 泛素化，則被 ARIH1 的敲除所阻斷。

因此，該團隊得出結(jié)論，GSK3α 驅(qū)動PD-L1的 Ser279/283 磷酸化，PD-L1隨后招募 ARIH1 并通過 K48 相關(guān)泛素鏈將自身泛素化，并靶向蛋白酶體降解。

在活體實驗方面，該團隊分別使用 4T1 小鼠乳腺癌細胞、免疫缺陷裸鼠、和野生型正常小鼠，來評估 ARIH1 在調(diào)控 PD-L1 降解和腫瘤發(fā)生中的作用。

據(jù)悉，當4T1細胞注射到 BALB/c 小鼠（白變種實驗室老鼠，即俗稱的 “小白鼠 “）中時，小白鼠體內(nèi)可自發(fā)產(chǎn)生高轉(zhuǎn)移性腫瘤，并在注射部位形成原發(fā)灶。實驗表明，4T1細胞在小白鼠中的生長轉(zhuǎn)移特性與人體中的三陰性乳腺癌非常相似。

在4T1細胞中高表達 ARIH1，對4T1細胞的體外增殖、以及在免疫缺陷裸鼠的生長并沒有影響。但是，在免疫功能正常的小白鼠中，ARIH1高表達腫瘤生長受到了極大的抑制，其中大部分小白鼠的腫瘤完全消退。

同時，在 ARIH1 高表達腫瘤微環(huán)境中，浸潤腫瘤的免疫細胞、活化 CD8 + 細胞、毒性 T 細胞的水平明顯增加。并且，ARIH1 高表達還導(dǎo)致炎癥細胞因子的表達增加，包括干擾素 -γ、腫瘤壞死因子 -α 、炎性趨化因子 CCL-5 、以及 T 淋巴細胞趨化因子 CXCL-10等。

4T1 系小鼠乳腺癌細胞，是逃離免疫系統(tǒng)攻擊的癌細胞中的佼佼者，ARIH1 能使免疫系統(tǒng)發(fā)生活躍的炎性反應(yīng)，這說明 ARIH1 在促進腫瘤免疫方面發(fā)揮了明顯作用，誘導(dǎo)ARIH1高表達的藥物在腫瘤免疫療中的應(yīng)用前景，非常值得期待。

那么在人體中，腫瘤細胞也是通過該機制來逃避免疫系統(tǒng)攻擊的嗎？

對腫瘤和其遠端組織樣本的免疫組化分析顯示， ARIH1 蛋白水平在遠端組織中的水平遠高于腫瘤組織。

這一發(fā)現(xiàn)與細胞與小鼠實驗中 ARIH1 促進 PD-L1 降解的現(xiàn)象是一致的，這說明人體腫瘤細胞中 ARIH1 表達的缺失，是導(dǎo)致腫瘤細胞PD-L1 蛋白累積的機制之一。

但導(dǎo)致腫瘤中 ARIH1 表達水平下降的機制還有待闡明。

圖 | 經(jīng) EGFR-GSK3α-ARIH1 調(diào)控的 PD-L1 膜蛋白降解示意圖

治愈疑難腫瘤未來可期，“冷腫瘤” 變 “熱腫瘤”

考慮到4T1細胞是一種著名的冷腫瘤，PD-1/PD-L1抗體單獨使用幾乎對4T1腫瘤沒有抑制作用，本研究結(jié)果還提示，ARIH1不僅可以調(diào)控PD-L1降解，而且可以重塑腫瘤微環(huán)境，可能是將“冷腫瘤”變成“熱腫瘤”的關(guān)鍵分子。夏宏光課題組通過后續(xù)的研究已經(jīng)初步探明ARIH1調(diào)控腫瘤“冷”、“熱”切換的機制，并開始篩選誘導(dǎo)ARIH1高表達的先導(dǎo)化合物。

臨床上三陰性乳腺癌也是著名的 “冷腫瘤”，PD-1抗體在該適應(yīng)癥上的臨床實驗已經(jīng)失?。槐狙芯砍晒崾?，誘導(dǎo)ARIH1表達的藥物小分子有望成為治療包括三陰性乳腺癌在內(nèi)的一系列“冷腫瘤”的靶向新藥。也就是說，在未來的某一天，治愈三陰性乳腺癌、難治性黑色素瘤、非小細胞肺癌等 “冷腫瘤”將不再是幻想！

2021 年初，夏宏光已成立公司，他表示本次成果也將在該公司進行轉(zhuǎn)化。夏宏光博士也是良渚實驗室研究員，負責(zé)“分子篩選與合成平臺”與個性化藥物篩選。

良渚實驗室是浙江省實驗室之一，成立于 2020 年 7 月，定位是“浙江省醫(yī)學(xué)科技策源地，生命健康產(chǎn)業(yè)主引擎”。良渚是杭州的一處地名，也是“中華文明的曙光 —— 良渚文化的發(fā)祥地”，以“良渚”命名該實驗室，足見用意之深遠。

夏宏光從事“選擇性自噬” 研究逾十五年，師從美國科學(xué)院院士袁鈞瑛教授和中國科學(xué)院院士馬大為教授。他和馬大為院士合作開發(fā)的第三代 EGFR（自噬上游調(diào)控蛋白）有機小分子抑制劑 ES-072，已獲美國臨床批和中國 1.1 類新藥臨床批件，且已初步完成臨床 I 期實驗。

談及未來，他說，“希望所在團隊成為全球選擇性自噬藥物開發(fā)的領(lǐng)跑者?！?/p>

來源：麻省理工科技評論