鏈霉菌是許多重要天然產物的生產者，其基因組蘊含著大量未被開發(fā)的次級代謝生物合成基因簇。傳統的基于雙鏈斷裂的CRISPR/Cas9技術雖然已應用于鏈霉菌的基因組編輯，但需提供外源修復模板，且在多位點同時編輯的應用上仍有局限性。近年來，單堿基編輯技術已應用于天藍色鏈霉菌等一些模式菌株中，相較于傳統CRISPR技術更為方便快捷。堿基編輯的效率與底盤菌株尿嘧啶DNA糖苷酶（UDG）的功能密切相關，前期研究多用枯草芽孢桿菌噬菌體來源的尿嘧啶DNA糖苷酶抑制因子UGI來提升堿基編輯效率，但在某些情況下，其抑制效果并不理想。

　　中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所研究員王猛帶領的高通量編輯與篩選平臺實驗室，與天津科技大學教授花而并團隊合作，在模式菌株變鉛青鏈霉菌Streptomyces lividans?66中研究了UDG與堿基編輯效率的關系，開發(fā)出新一代堿基編輯器asRNA-BE（antisense RNA interference-enhanced CRISPR/Cas9 Base Editing method）。科研人員利用融合了胞苷脫氨酶rAPOBEC1的BE系列堿基編輯器，實現基因組三個次級代謝基因的編輯。在此基礎上，利用CRISPR/Cas9輔助的基因敲除手段，分別構建了尿嘧啶DNA糖苷酶UDG1和UDG2的單敲和雙敲菌株，發(fā)現在失活UDG1的情況下，堿基編輯效率可較原始提高3.4倍到67.4倍不等。考慮到UDG是細胞修復過程中的關鍵酶，其長期缺失不利于菌株基因組的穩(wěn)定，科研人員利用反義RNA干擾降低基因表達水平的策略代替基因敲除，在原始的BE編輯器基礎上整合了針對UDG的反義RNA干擾模塊，構建了新一代堿基編輯器asRNA-BE，將編輯效率提高至原來的2.8倍到65.8倍不等。asRNA-BE編輯器可以在堿基編輯過程中瞬時抑制UDG的表達，而在編輯結束后又可以通過溫敏型質粒的消除恢復UDG的表達水平，在提高編輯效率的同時避免了對于細胞不可逆的傷害。基因組測序結果也表明，與BE編輯器相比，asRNA-BE編輯器在大幅度提高編輯效率的同時，并未引起額外的脫靶，在工業(yè)菌株改造等方面具有良好的應用前景。

　　相關研究成果以封面文章形式發(fā)表在ACS Synthetic Biology上。天津工生所助理研究員張玥為論文第一作者。研究工作得到國家重點研發(fā)計劃、天津市合成生物技術創(chuàng)新能力提升行動、國家自然科學基金等的支持。

　　論文鏈接

　　封面文章

　　asRNA-BE編輯器在變鉛青鏈霉菌中的應用

來源： 天津工業(yè)生物技術研究所