2021年5月24日，清華大學(xué)饒子和院士婁智勇研究員團(tuán)隊(duì)與上海科技大學(xué)高巖博士合作在《Cell》（細(xì)胞）雜志發(fā)表研究論文，解析新冠病毒超分子蛋白質(zhì)機(jī)器“轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體”關(guān)鍵狀態(tài)的三維結(jié)構(gòu)，揭示了病毒mRNA加帽、基因組復(fù)制矯正、逃逸核苷類(lèi)抗病毒藥物的分子機(jī)制。這是該團(tuán)隊(duì)在新冠病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體研究中，繼在《Science》（科學(xué)）、《Cell》（細(xì)胞）等期刊上連續(xù)發(fā)表4項(xiàng)成果后的又一重要工作。

新冠病毒肺炎疫情至今已造成全球1.4億人感染和300余萬(wàn)人死亡。隨著疫情進(jìn)展，突變病毒株不斷出現(xiàn)，對(duì)中和抗體和疫苗的防護(hù)效果提出了嚴(yán)重挑戰(zhàn)，迫切需要針對(duì)各型突變株中高度保守的轉(zhuǎn)錄復(fù)制過(guò)程開(kāi)展深入研究，闡明關(guān)鍵藥物靶點(diǎn)的工作機(jī)制，發(fā)現(xiàn)能夠有效應(yīng)對(duì)各種突變株的抗病毒藥物。

新冠病毒是目前已知RNA病毒中基因組最大的一種病毒（約30 kb），其基因組編碼了一系列非結(jié)構(gòu)蛋白，并按照一定的空間和時(shí)間順序，形成復(fù)雜的超分子蛋白質(zhì)機(jī)器“轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體”（RTC），負(fù)責(zé)病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制的核心過(guò)程，包含了眾多保守的抗病毒藥物設(shè)計(jì)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。由于基因組極大，同時(shí)聚合酶復(fù)制保守性較差，新冠病毒進(jìn)化出一種獨(dú)特的“復(fù)制矯正”（proofreading）機(jī)制，利用轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體中關(guān)鍵的nsp14蛋白對(duì)復(fù)制過(guò)程進(jìn)行矯正，一旦發(fā)現(xiàn)聚合酶合成了錯(cuò)誤配對(duì)的堿基，立刻通過(guò)nsp14具有的外切核酸酶（ExoN）將錯(cuò)誤堿基處理掉，保證復(fù)制的準(zhǔn)確進(jìn)行，這也是病毒逃逸核苷類(lèi)抗病毒藥物的關(guān)鍵途徑。同時(shí)，nsp14是一個(gè)獨(dú)特的雙功能蛋白，除負(fù)責(zé)復(fù)制矯正的外切核酸酶外，還擁有一個(gè)N7甲基化酶（N7-MTase），負(fù)責(zé)mRNA加帽過(guò)程關(guān)鍵的第三步催化反應(yīng)。復(fù)制矯正和加帽過(guò)程如何進(jìn)行，特別是兩個(gè)截然不同的生化過(guò)程如何在一個(gè)nsp14蛋白中協(xié)同作用，是20多年來(lái)冠狀病毒研究領(lǐng)域中最關(guān)鍵的幾個(gè)“未解之謎”之一。

新冠疫情爆發(fā)后，清華大學(xué)饒子和院士婁智勇研究員團(tuán)隊(duì)針對(duì)新冠病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制機(jī)制開(kāi)展的深入研究，先后闡明了“核心轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體”（C-RTC）[1]、“延伸轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體”（E-RTC）[2]和“加帽中間態(tài)轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體”[Cap(-1)’-RTC][3]的工作機(jī)制。在此基礎(chǔ)上，研究團(tuán)隊(duì)成功解析了Cap(-1)’-RTC與nsp10/nsp14形成的超級(jí)復(fù)合體Cap(0)-RTC的三維結(jié)構(gòu)（圖1）。

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圖1 新冠病毒Cap(0)-RTC的工作機(jī)制

在該復(fù)合體中，nsp9蛋白發(fā)揮了“適配器”（adaptor）的作用，通過(guò)與nsp14蛋白相互作用，將nsp10/nsp14復(fù)合體招募到Cap(-1)’-RTC中，從而利用nsp14的N7甲基化酶結(jié)構(gòu)域完成mRNA加帽過(guò)程的第三步關(guān)鍵反應(yīng)。尤為重要的是，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)Cap(0)-RTC在溶液狀態(tài)下會(huì)形成穩(wěn)定的同源二聚體。在二聚體中，解旋酶nsp13通過(guò)其1B結(jié)構(gòu)域的重大構(gòu)象變化，引導(dǎo)模板核酸鏈反向移動(dòng)，引發(fā)產(chǎn)物鏈回溯（backtracking）機(jī)制，從而將產(chǎn)物鏈3’末端傳輸至另一Cap(0)-RTC的nsp14外切核酸酶結(jié)構(gòu)域的反應(yīng)中心，完成錯(cuò)配堿基的矯正過(guò)程（圖2）。

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圖2 新冠病毒復(fù)制矯正的反式回溯（in trans backtracking）機(jī)制

這一發(fā)現(xiàn)所提出的反式回溯（in trans backtracking）的復(fù)制矯正機(jī)制，與真核/原核細(xì)胞RNA聚合酶Pol II的復(fù)制矯正機(jī)制具有一定的類(lèi)似性，表明作為基因組最復(fù)雜的RNA病毒，新冠病毒的轉(zhuǎn)錄復(fù)制過(guò)程已與高等生物具有一定的類(lèi)似性，闡明了冠狀病毒研究領(lǐng)域20多年來(lái)懸而未決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。同時(shí)，復(fù)制矯正機(jī)制是新冠病毒逃逸核苷類(lèi)抗病毒藥物（如瑞德西韋）的關(guān)鍵機(jī)制，一旦核苷類(lèi)藥物被加入RNA產(chǎn)物鏈中，即會(huì)被病毒的復(fù)制矯正過(guò)程去除，從而喪失抑制活性，目前僅有NHC及其衍生物可以逃逸該過(guò)程。該成果也將對(duì)未來(lái)進(jìn)一步優(yōu)化和發(fā)展新型核苷類(lèi)抗病毒藥物提供關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。相關(guān)研究成果于2021年5月24日在《Cell》在線(xiàn)發(fā)表[4]。

該成果的獲得得益于研究團(tuán)隊(duì)在冠狀病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制領(lǐng)域中17年多的長(zhǎng)期積累。自新冠疫情發(fā)生后，研究團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)研究了新冠病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制過(guò)程，闡明了關(guān)鍵藥物靶點(diǎn)蛋白主蛋白酶Mpro和轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體多個(gè)狀態(tài)三維結(jié)構(gòu)，為認(rèn)識(shí)病毒的生命過(guò)程、發(fā)展高效抗病毒藥物提供了關(guān)鍵信息，先后在《Nature》[5]、《Science》[1]、《Cell》上[3, 4, 6]和《Nature Communications》[2]上發(fā)表系列研究論文，是國(guó)際上抗新冠藥物靶點(diǎn)研究中最為系統(tǒng)、引用最多的工作之一。

清華大學(xué)饒子和院士婁智勇研究員和上?？萍即髮W(xué)的高巖博士為共同通訊作者，清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院助理研究員閆利明博士、楊云翔博士，以及博士生李明宇、張盈、鄭禮濤、葛基、黃雨岑、劉震宇為共同第一作者，研究工作得到上?？萍即髮W(xué)冷凍電鏡平臺(tái)的重要支持，受到科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、清華大學(xué)春風(fēng)基金、中科院先導(dǎo)專(zhuān)項(xiàng)的資助。

點(diǎn)評(píng)一：鐘南山，中國(guó)工程院院士

從“非典”到“新冠”，科學(xué)依靠堅(jiān)守

基礎(chǔ)研究是科技創(chuàng)新的源頭，是人類(lèi)認(rèn)識(shí)自然、適應(yīng)和改造自然的知識(shí)源泉，需要科學(xué)家長(zhǎng)期的堅(jiān)守和耕耘。

目前針對(duì)新冠病毒的抗病毒藥物研究，主要針對(duì)的是病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制過(guò)程的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白，如蛋白酶和聚合酶等。針對(duì)這兩個(gè)靶點(diǎn)的抑制劑已有相當(dāng)數(shù)量的進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)，例如瑞德西韋（Remdesivir）等。以瑞德西韋為代表的核苷類(lèi)抗病毒藥物主要作用于病毒的聚合酶，在被摻入產(chǎn)物核酸鏈后，阻斷病毒核酸的合成，進(jìn)而抑制病毒的轉(zhuǎn)錄復(fù)制過(guò)程。然而，在此類(lèi)抑制劑進(jìn)入臨床研究后，其抗病毒效果與預(yù)期有一定差距。除藥物代謝等問(wèn)題外，冠狀病毒通過(guò)特有的“復(fù)制矯正”（proofreading）機(jī)制逃逸核苷類(lèi)抗病毒藥物的抑制，可能是此類(lèi)抗病毒藥物抑制效果不佳的一個(gè)重要原因，目前僅有NHC及其衍生物能夠躲避病毒復(fù)制矯正機(jī)制的干擾。對(duì)這個(gè)機(jī)制開(kāi)展深入研究，將為今后發(fā)展廣譜、高效的抗冠狀病毒藥物提供關(guān)鍵的科學(xué)信息。

子和教授及其團(tuán)隊(duì)在新冠疫情爆發(fā)后，針對(duì)新冠病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制機(jī)制開(kāi)展了系統(tǒng)研究，先后闡明了“核心轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體”（C-RTC）[1]、“延伸轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體”（E-RTC）[2]和“加帽中間態(tài)轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體”[Cap(-1)’-RTC][3]的工作機(jī)制。在這些工作的基礎(chǔ)上，他們又在世界上第一次成功組裝成含有形式復(fù)制矯正功能的nsp14蛋白的超分子機(jī)器Cap(0)-RTC。通過(guò)結(jié)構(gòu)分析，他們發(fā)現(xiàn)在Cap(0)-RTC形成的同源二聚體中，解旋酶通過(guò)自身構(gòu)象改變，引導(dǎo)模板核酸鏈反向移動(dòng)，引發(fā)產(chǎn)物鏈“回溯”（backtracking）機(jī)制，進(jìn)而將產(chǎn)物鏈3’末端傳輸至另一Cap(0)-RTC的nsp14外切核酸酶結(jié)構(gòu)域的反應(yīng)中心。復(fù)制矯正機(jī)制是新冠病毒逃逸核苷類(lèi)抗病毒藥物的關(guān)鍵機(jī)制，一旦核苷類(lèi)藥物被加入RNA產(chǎn)物鏈中，在其被聚合酶感知為“錯(cuò)配堿基”后，立刻會(huì)被病毒的復(fù)制矯正過(guò)程去除，從而喪失抑制活性。他們的研究工作，為我們生動(dòng)展現(xiàn)了這一過(guò)程的可能機(jī)制。復(fù)制矯正的回溯機(jī)制，是從低等到高等生物細(xì)胞保證基因復(fù)制準(zhǔn)確性的重要機(jī)制，但在病毒中以往還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)此類(lèi)機(jī)制。這一研究成果不但發(fā)現(xiàn)病毒中的類(lèi)似機(jī)制，是認(rèn)識(shí)生命進(jìn)化的重要成果，而且為進(jìn)一步優(yōu)化和發(fā)展新型核苷類(lèi)抗病毒藥物提供了關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

子和教授自2003年SARS爆發(fā)后，就一直在冠狀病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制機(jī)制研究領(lǐng)域開(kāi)展工作，至今已堅(jiān)持了18年。2003年SARS疫情爆發(fā)期間，我當(dāng)時(shí)即已了解子和教授在SARS病毒的一系列成果，智勇教授那時(shí)才剛剛開(kāi)始博士階段的學(xué)習(xí)。子和教授的研究組在國(guó)際上率先解析了SARS-CoV主蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)[7]，并研發(fā)了一系列高效抑制劑[8]，他們當(dāng)時(shí)在轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體上的研究[9]至今仍被國(guó)際同行認(rèn)為是冠狀病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體機(jī)制研究的“開(kāi)篇之作”。這些積累，為新冠疫情爆發(fā)后他們?cè)谛鹿诓《净A(chǔ)研究中取得的一系列重要成果奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，通過(guò)闡明新冠病毒主蛋白酶和轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體多個(gè)狀態(tài)的三維結(jié)構(gòu)，為認(rèn)識(shí)該病毒的生命過(guò)程、發(fā)展高效抗病毒藥物提供了關(guān)鍵信息，先后在《Nature》[5]、《Science》[1]、《Cell》上[3, 6]和《Nature Communications》[2]上發(fā)表系列研究論文，是國(guó)際上抗新冠藥物靶點(diǎn)研究中最為系統(tǒng)、引用最多的工作之一。

2020年9月11日，習(xí)近平總書(shū)記在科學(xué)家座談會(huì)上總結(jié)了新時(shí)代科學(xué)家精神，強(qiáng)調(diào)要有勇攀高峰、敢為人先的創(chuàng)新精神，追求真理、嚴(yán)謹(jǐn)治學(xué)的求實(shí)精神，淡泊名利、潛心研究的奉獻(xiàn)精神，集智攻關(guān)、團(tuán)結(jié)協(xié)作的協(xié)同精神，甘為人梯、獎(jiǎng)掖后學(xué)的育人精神。18年來(lái)，子和教授的團(tuán)隊(duì)中有100多人先后參與冠狀病毒研究，累計(jì)發(fā)表50余篇研究論文，引用超過(guò)6000余次，均篇引用超過(guò)100次，一批早期參與的俊彥陸續(xù)成長(zhǎng)為國(guó)家科研骨干。科學(xué)依靠堅(jiān)守，子和教授團(tuán)隊(duì)在冠狀病毒的奮斗歷程，對(duì)科學(xué)家精神做了一個(gè)很好的詮釋。

點(diǎn)評(píng)二：康樂(lè)，中國(guó)科學(xué)院院士

從結(jié)構(gòu)生物學(xué)角度認(rèn)識(shí)新冠病毒的轉(zhuǎn)錄復(fù)制機(jī)制

新冠病毒造成的疫情，是近一個(gè)世紀(jì)以來(lái)人類(lèi)面對(duì)的最大的一次公共衛(wèi)生事件，深入研究病毒生命周期的分子機(jī)制，是認(rèn)識(shí)病毒特征、研發(fā)抗病毒手段的關(guān)鍵所在。新冠病毒非常特殊，它的基因組是目前已知RNA病毒中基因組最大的一種，其生命過(guò)程所涉及的分子機(jī)制也非常復(fù)雜。新冠病毒通過(guò)兩個(gè)機(jī)制保證蛋白質(zhì)翻譯和相對(duì)準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄復(fù)制過(guò)程，一是要在病毒mRNA前端加上一個(gè)帽結(jié)構(gòu)（cap），用于維持mRNA的穩(wěn)定性和蛋白翻譯的有效進(jìn)行；二是通過(guò)一個(gè)獨(dú)特的“復(fù)制矯正”（proofreading）機(jī)制，對(duì)病毒基因組的復(fù)制實(shí)施控制，一旦發(fā)現(xiàn)核酸中的錯(cuò)配堿基，隨時(shí)進(jìn)行修正。病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體上的nsp14蛋白參與了這兩個(gè)關(guān)鍵過(guò)程，可通過(guò)其C端的N7甲基化酶完成mRNA加帽過(guò)程的第三步催化反應(yīng)，同時(shí)還可通過(guò)其N(xiāo)端的外切核酸酶完成復(fù)制矯正過(guò)程。這一現(xiàn)象在“非典”病毒（SARS-CoV）即已發(fā)現(xiàn)，但20年來(lái)一直無(wú)法回答兩個(gè)截然不同的過(guò)程如何由一個(gè)蛋白來(lái)協(xié)同執(zhí)行，是冠狀病毒研究領(lǐng)域中多年來(lái)關(guān)注的核心基礎(chǔ)生物學(xué)問(wèn)題之一。

清華大學(xué)饒子和教授婁智勇研究員團(tuán)隊(duì)與上?？萍即髮W(xué)合作在Cell發(fā)表的這一工作，解析了兩種不同狀態(tài)的“Cap(0)轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體”Cap(0)-RTC的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體中，病毒編碼的nsp9蛋白發(fā)揮了“適配器”（adaptor）的作用，將nsp10/nsp14形成的復(fù)合體招募到聚合酶上，與聚合酶上的NiRAN結(jié)構(gòu)域共同形成一個(gè)“共轉(zhuǎn)錄加帽復(fù)合體”（Co-transcriptional Capping Complex, CCC），展示了mRNA加帽過(guò)程中，mRNA 5’端在多個(gè)關(guān)鍵酶分子之間的傳輸路徑，第一次明確揭示了基因組超大的RNA病毒是如何將以聚合酶為中心的“延伸復(fù)合體”（Elongation Complex,? EC）與“加帽復(fù)合體”連接起來(lái)。更加重要的是，他們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)Cap(0)轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體在溶液狀態(tài)下會(huì)形成穩(wěn)定的同源二聚體，通過(guò)深入研究該二聚體的結(jié)構(gòu)，提出了冠狀病毒復(fù)制矯正中稱(chēng)之為反式回溯（in trans backtracking）的機(jī)制。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在二聚體中，一個(gè)Cap(0)轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體的聚合酶催化中心與另一個(gè)Cap(0)轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體的nsp14外切核酸酶結(jié)構(gòu)域催化中心相對(duì)，使合成的產(chǎn)物RNA 3’末端能夠通過(guò)回溯的方式傳輸?shù)絥sp14外切核酸酶結(jié)構(gòu)域進(jìn)行加工。同時(shí)，他們還發(fā)現(xiàn)解旋酶nsp13的1B結(jié)構(gòu)域發(fā)生了重大構(gòu)象變化，并通過(guò)與模板核酸鏈的作用，引導(dǎo)模板核酸鏈反向移動(dòng)，引發(fā)產(chǎn)物鏈回溯機(jī)制。值得指出的是，通過(guò)回溯的方式進(jìn)行復(fù)制矯正，在真核/原核細(xì)胞中廣泛存在，但是在病毒中還是第一次觀察到此類(lèi)機(jī)制。雖然該過(guò)程與真核/原核細(xì)胞Pol II轉(zhuǎn)錄過(guò)程的復(fù)制矯正機(jī)制具有一定類(lèi)似性，但在Pol II的研究中，并未觀測(cè)到蛋白具有巨大的構(gòu)象變化，因而Pol II中回溯的驅(qū)動(dòng)力也不是十分明確，而該工作表明解旋酶通過(guò)構(gòu)象變化提供了回溯的驅(qū)動(dòng)力，為深入理解這一基礎(chǔ)生物學(xué)過(guò)程提供了重要范例。

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來(lái)源：清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院