6月10日凌晨，中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所研究員薛愿超課題組及其合作者在Nature Cell Biology上，在線發(fā)表了題為Global profiling of RNA-binding protein target sites by LACE-seq的論文。

人類基因組編碼了約1500個(gè)RNA結(jié)合蛋白（RNA-binding protein, RBP），它們往往通過(guò)結(jié)合RNA分子上的特定基序或結(jié)構(gòu)元件而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)各種RNA分子的加工、定位、翻譯和穩(wěn)定性等。研究表明，RBP在早期生殖、個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖和凋亡等幾乎所有的生理過(guò)程中都發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)控作用。RNA結(jié)合蛋白的突變會(huì)導(dǎo)致多種遺傳性疾病，比如，F(xiàn)US和TDP43的突變可導(dǎo)致肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥，而U2AF35、SF3B1等的突變會(huì)導(dǎo)致骨髓增生異常綜合癥的發(fā)生。準(zhǔn)確鑒定RBP的結(jié)合靶標(biāo)及精確結(jié)合位置是理解其生理和病理調(diào)控機(jī)制的前提。

目前，常用的鑒定RBP靶標(biāo)的方法主要有RIP-seq和CLIP-seq。由于這兩種方法均依賴于利用特異性抗體富集RBP及其所結(jié)合的RNA，且需要百萬(wàn)數(shù)量級(jí)的細(xì)胞，因此，限制了這些方法在稀有細(xì)胞類型及臨床穿刺樣本中的應(yīng)用。例如，RBP在早期生殖和胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，但由于缺乏可在微量細(xì)胞甚至單細(xì)胞水平研究RBP靶標(biāo)的實(shí)驗(yàn)方法，導(dǎo)致早期生殖過(guò)程中RBP及其復(fù)合物的分子機(jī)制研究仍缺少。針對(duì)該領(lǐng)域存在的難題以及現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)方法的缺點(diǎn)，薛愿超課題組及合作者于近期開(kāi)發(fā)了可在微量細(xì)胞中鑒定RBP作用靶點(diǎn)的新技術(shù)LACE-seq（Linear amplification of cDNA ends and sequencing）。通過(guò)線性擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄酶在RBP結(jié)合位點(diǎn)處的終止信號(hào)，該研究首次實(shí)現(xiàn)了在單堿基分辨率和單細(xì)胞層面精準(zhǔn)鑒定RBP的結(jié)合位點(diǎn)，為研究RBP在胚胎發(fā)育和生殖疾病中的功能機(jī)制打開(kāi)了大門(mén)。

利用創(chuàng)建的LACE-seq方法，研究團(tuán)隊(duì)取得如下研究成果：（1）首次在卵細(xì)胞中繪制出Ddx4、Ptbp1、Ago2和Mili等RBP的具體靶標(biāo)和結(jié)合位置；（2）率先發(fā)現(xiàn)Ago2/endo-siRNA沉默復(fù)合物在卵細(xì)胞中以非完全互補(bǔ)配對(duì)的方式抑制mRNA的翻譯，并證明endo-siRNA的靶標(biāo)Bub3、Chk1、Nuf2等的蛋白質(zhì)水平變化可能與Ago2敲除后的表型相關(guān)；（3）證明了Ago2/endo-siRNA復(fù)合物可切割由逆轉(zhuǎn)座子（Long-terminal repeat retrotransposons）啟動(dòng)子起始的嵌合體RNA，該機(jī)制確保了卵細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄組的完整性。

研究工作獲得科學(xué)技術(shù)部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金委和中科院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)等的資助。生物物理所博士研究生蘇瑞寶、副研究員曹唱唱和中科院動(dòng)物研究所博士研究生樊立華為論文的共同第一作者；薛愿超、動(dòng)物所及廣東省第二人民醫(yī)院教授孫青原、北京大學(xué)及北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心教授黃超蘭為論文的共同通訊作者。

論文鏈接

LACE-seq方法可在微量細(xì)胞中準(zhǔn)確鑒定PTBP1的結(jié)合靶標(biāo)

來(lái)源： 生物物理研究所