8月17日，中國科學院腦科學與智能技術卓越創(chuàng)新中心、神經科學國家重點實驗室、上海腦科學與類腦研究中心研究員楊輝研究組在Protein & Cell上發(fā)表了題為Precise Genome Editing without Exogenous Donor DNA via Retron Editing System in Human Cells 的研究論文，該研究優(yōu)化了Retron系統(tǒng)，首次證明了Retron系統(tǒng)在哺乳動物細胞中的可適用性，對于該系統(tǒng)在高等真核生物細胞中的進一步應用具有指導意義。

細菌在與噬菌體的長期博弈中發(fā)展出許多防御體系，其中就包括CRISPR系統(tǒng)。CRISPR-Cas系統(tǒng)的出現推動了精準基因組編輯的發(fā)展。CRISPR-Cas9引起的DNA雙鏈斷裂（DSB）主要由非同源末端連接途徑 （NHEJ）而不是同源重組修復途徑（HDR）介導修復。研究發(fā)現，使用單鏈DNA作為模板、提高Cas9誘導的DSB位點附近的模板DNA濃度，可以有效提高HDR效率。近來發(fā)現Retron系統(tǒng)也在細菌防御噬菌體中發(fā)揮重要作用。2018年，美國斯坦福大學研究人員開發(fā)的CRISPEY將Retron系統(tǒng)與CRIPSR系統(tǒng)結合，通過Retron系統(tǒng)在細胞內逆轉錄產生單鏈供體模板DNA，并將其與sgRNA共價偶聯(lián)。在酵母細胞中，CRISPEY可以在酵母細胞中高效精確地（>80%編輯效率）敲入長達700bp的DNA序列。但是，Retron系統(tǒng)在哺乳動物細胞是否可以工作尚未研究。

楊輝研究組通過將四種已被報道具有功能的retron系統(tǒng)（Ec48、Ec73、Ec86和Ec107）在哺乳動物細胞內的表達，證明了細菌retron系統(tǒng)能在哺乳動物細胞中逆轉錄產生單鏈DNA。通過將retron RT融合于Cas9蛋白的N端或C端 (RT-Cas9 or Cas9-RT)，以及將retron ncRNA連接于sgRNA的5’端或3’端（5’rgRNA or 3’rgRNA），研究發(fā)現Cas9-Ec73RT和3’ Ec73 rgRNA的組合能最有效地在哺乳動物細胞內完成精準DNA編輯（~10%編輯效率）。該研究初步探索了Retron editing在哺乳動物細胞中的應用, 驗證了Retron Editing用于哺乳動物細胞精準基因編輯的可行性。

相較于目前常用的DNA單堿基編輯及Prime editing，依賴HDR機制的Retron editing受到PAM位置的限制相對較小，并且Retron editing系統(tǒng)不需要額外提供外源供體模板DNA。此外，目前在植物細胞中由于HDR效率低及外源同源重組供體模板DNA遞送困難等原因造成基因 (尤其是長片段) 敲入的效率較低，不需要提供外源供體模板DNA的Retron editing系統(tǒng)可能為植物基因組編輯提供新選擇。未來，經過優(yōu)化升級工作，Retron editing系統(tǒng)有望應用于腦疾病治療及作物性狀改良等領域。

論文鏈接

Retron Editing工作示意圖及其與DNA堿基編輯器、Prime editing的比較

來源： 腦科學與智能技術卓越創(chuàng)新中心