2022年2月9日，清華大學醫(yī)學院郭永團隊與北京大學第一醫(yī)院、首都醫(yī)科大學附屬北京婦產醫(yī)院合作，在國際著名學術期刊《分析化學》（Analytical Chemistry）發(fā)表了題為“用于脊髓性肌肉萎縮癥分子診斷和疾病嚴重程度評估的單管多重數字聚合酶鏈式反應檢測方法”（Single-Tube Multiplex Digital Polymerase Chain Reaction Assay for Molecular Diagnosis and Prediction of Severity of Spinal Muscular Atrophy）的文章，并被選為雜志封面。脊髓性肌萎縮癥（Spinal muscular atrophy，SMA）是兒童最常見的遺傳性神經肌肉病，目前用于SMA相關基因檢測和拷貝數確定的方法復雜、耗時或無法同時檢測多個靶標。本研究基于數字PCR技術建立了能夠在單管完成SMN1外顯子7和8與SMN2外顯子7和8拷貝數檢測的方法，具有準確、快速、操作簡單、樣本用量少和適用于多種類型樣本的優(yōu)勢，為SMA的分子診斷、大規(guī)模篩查和疾病嚴重程度評估提供了一個有力的工具。

2.研究背景

2021年12月，國家醫(yī)保局公布一批新藥進醫(yī)保，全球首個用于治療SMA的高價藥物——諾西那生鈉注射液名列其中，罕見病SMA也因此受到大眾關注。SMA是一種嚴重的神經肌肉疾病，其特征是脊髓前角α-運動神經元的退化變性，導致近端肌肉逐漸無力、萎縮和癱瘓，發(fā)病率約為1/10000，人群攜帶率約為1/50，是導致新生兒死亡的重要遺傳因素之一。SMA是一種常染色體隱性遺傳病，95%的患者是由于SMN1基因7號外顯子純合缺失而致?。ù蟛糠?i>SMN1基因8號外顯子共同缺失）；另一個與SMN1高度同源的基因SMN2已被證實與疾病嚴重程度相關，SMN2的拷貝數在治療與用藥中被作為重要參考數據。因此，精準的檢測出SMN1和SMN2的拷貝數對于臨床疾病診斷、攜帶者篩查、疾病嚴重性預測評估、治療和預后至關重要。

3.方法與結果

本研究建立了一種基于數字PCR單管檢測SMN1外顯子7和8、SMN2外顯子7和8及內參基因的方法，通過數字PCR技術絕對定量目標基因和內參基因的模板拷貝數，計算目標基因與內參基因模板拷貝數的比值來實現(xiàn)目標基因拷貝數的檢測（圖1）。作者以不同的熒光染料標記5個基因的探針，并配合新羿生物的5色微液滴數字PCR系統(tǒng)進行檢測，實現(xiàn)了5個基因單管檢測。此外，為了能夠區(qū)分高度同源的SMN1和SMN2基因（在外顯子7和外顯子8上各只有1個堿基的差異），作者使用了小溝結合物（Minor groove binder，MGB）和鎖核酸（Locked nucleic acid，LNA）對檢測探針進行修飾。

圖1基于數字PCR的SMA檢測流程

為了驗證方法的準確性，作者收集了共317例不同類型的臨床樣本進行檢測，包括外周血、羊水、絨毛、口腔拭子和干血斑。在317例樣本中，共有22例患者、72例攜帶者和223例正常人（圖2），結果顯示該方法對于不同類型的樣本都能夠實現(xiàn)目標基因拷貝數準確的檢測。此外，作者也觀察到了SMN2基因拷貝數更多的SMA患者具有更輕的表型；通過對目標基因的同時檢測，亦觀察到患者、攜帶者和正常人群中都出現(xiàn)基因轉換而產生融合基因的情況。

圖2不同類型的臨床樣本的SMN1和SMN2檢測結果分布（TGR：Target gene ratio,目標基因與內參基因模板拷貝數的比值）

與現(xiàn)有的檢測方法如限制性片段長度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）和熒光定量PCR（Quantitative PCR，qPCR）相比，本方法能精準檢測更多靶標，且對模板量要求低（≥ 1.5 ng）；與金標準方法多重連接探針擴增（Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）相比，本方法檢測周期更短（首次出結果24 hvs2.5 h）、操作更簡單、對模板量的要求低和適用于更多種類型樣本。

4.研究結論

本工作研發(fā)了基于數字PCR技術的SMA精準檢測方法，能夠在單管完成SMN1外顯子7和8與SMN2外顯子7和8拷貝數的檢測，具有檢測準確、檢測快速、操作簡單、檢測限低和適用于多種類型樣本的優(yōu)勢，為SMA分子診斷、大規(guī)模篩查和疾病嚴重程度評估提供了一個有力的工具。

5.作者介紹

清華大學陳芊如與首都醫(yī)科大學附屬北京婦產醫(yī)院閆有圣為該研究的共同第一作者，清華大學郭永與北京大學第一醫(yī)院馬祎楠為該研究的共同通訊作者。該研究得到了科技部國家重點研發(fā)計劃、清華大學春風基金和國家自然科學基金委青年科學基金的聯(lián)合資助。

原文鏈接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c04403

來源：清華大學