自從2009年單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)被首次報(bào)道以來(lái)，單細(xì)胞組學(xué)測(cè)序技術(shù)迅猛發(fā)展，為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供了一系列強(qiáng)大、精準(zhǔn)的研究工具。2022年2月28日，北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）、生命科學(xué)學(xué)院湯富酬教授與文路副研究員受邀在Precision Clinical Medicine上發(fā)表綜述，從四個(gè)方面總結(jié)了近年來(lái)單細(xì)胞組學(xué)測(cè)序技術(shù)的最新研究進(jìn)展，特別聚焦于其在人類干細(xì)胞研究方面的應(yīng)用。

第一、單細(xì)胞表觀基因組測(cè)序技術(shù)的最新進(jìn)展。

表觀遺傳調(diào)控是細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心，其包括染色質(zhì)狀態(tài)、三維基因組、DNA甲基化、組蛋白修飾和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等多個(gè)互為補(bǔ)充、協(xié)同調(diào)控的層面，以實(shí)現(xiàn)在每個(gè)細(xì)胞中精確調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的目的。近年來(lái)單細(xì)胞表觀基因組測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅速，尤其是基于Tn5轉(zhuǎn)座子的染色質(zhì)可及性測(cè)序ATAC-seq技術(shù)，因其簡(jiǎn)便高效而得到大力發(fā)展和廣泛使用。基于enzyme-tethering策略的CUT&Tag等技術(shù)為組蛋白修飾和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的單細(xì)胞分析提供了新的工具。文章從單細(xì)胞染色質(zhì)狀態(tài)、三維基因組、組蛋白修飾和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、DNA甲基化和染色質(zhì)狀態(tài)/轉(zhuǎn)錄組雙組學(xué)五個(gè)方面進(jìn)行了綜述。

第二、單細(xì)胞基因組測(cè)序技術(shù)用于譜系追蹤的最新進(jìn)展。

模式動(dòng)物中的基于轉(zhuǎn)基因標(biāo)記和單細(xì)胞組學(xué)測(cè)序的譜系追蹤技術(shù)近年來(lái)取得長(zhǎng)足進(jìn)展，但是由于倫理限制，這些技術(shù)無(wú)法用于人類在體組織器官的譜系追蹤。組織器官發(fā)育經(jīng)歷了不斷的細(xì)胞分裂與分化。然而，細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制并非百分百精確，每次細(xì)胞分裂都會(huì)隨機(jī)產(chǎn)生少量突變，這些體細(xì)胞突變不斷積累，可作為識(shí)別和追蹤細(xì)胞譜系關(guān)系的獨(dú)特標(biāo)志，這就從根本上解決了對(duì)人體組織器官細(xì)胞的譜系追蹤問(wèn)題。體細(xì)胞突變的類型包括單核苷酸變異（SNV）、微衛(wèi)星序列改變、轉(zhuǎn)座子重復(fù)序列改變、拷貝數(shù)變異（CNV）和線粒體突變等。近年來(lái)，研究通過(guò)單細(xì)胞分辨率的基因組突變測(cè)序分析，初步探索了人類胚胎和器官發(fā)育譜系圖譜。文章從單細(xì)胞基因組測(cè)序技術(shù)和基因組突變信息兩方面進(jìn)行了綜述。

第三、單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的最新進(jìn)展。

細(xì)胞在生物體內(nèi)所處的空間位置常常對(duì)其命運(yùn)決定和生理功能有重要影響。近年來(lái)，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)進(jìn)展迅速，這些技術(shù)尤其適用于無(wú)法進(jìn)行遺傳學(xué)標(biāo)記的人類組織樣本的研究?？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)包括三類技術(shù)：第一類是單分子熒光原位雜交技術(shù)，第二類是原位測(cè)序技術(shù)，第三類是基于原位捕獲策略的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)。前兩類技術(shù)具有單細(xì)胞分辨率，第三類技術(shù)正在接近單細(xì)胞分辨率。文章對(duì)這些技術(shù)進(jìn)行了綜述。

第四、基于第三代測(cè)序技術(shù)（單分子測(cè)序技術(shù)）的單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)的最新進(jìn)展。

近年來(lái)，包括納米孔測(cè)序和單分子熒光測(cè)序在內(nèi)的單分子長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)（即第三代測(cè)序技術(shù)）發(fā)展迅速。三代單分子長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)用于單細(xì)胞組學(xué)與二代短讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)相比有幾方面優(yōu)點(diǎn)（圖1）。其一、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組三代測(cè)序（單分子長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序）方法對(duì)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行直接測(cè)序，從而能夠有效地檢測(cè)可變剪接轉(zhuǎn)錄本。湯富酬課題組與王洋團(tuán)隊(duì)合作開(kāi)發(fā)了基于三代單分子測(cè)序平臺(tái)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法SCAN-seq，在小鼠植入前胚胎中檢測(cè)到了27,250 個(gè)未注釋轉(zhuǎn)錄本（Fan et al., 2020）。其二、單細(xì)胞基因組三代測(cè)序方法能夠有效地檢測(cè)結(jié)構(gòu)變異，特別是復(fù)雜結(jié)構(gòu)變異。雖然二代短讀長(zhǎng)測(cè)序能夠有效地檢測(cè)包括單核苷酸變異和短插入或缺失在內(nèi)的基因組變異，但是對(duì)于包括長(zhǎng)片段插入或缺失、基因組重復(fù)、異位和環(huán)狀DNA等在內(nèi)的基因組結(jié)構(gòu)變異的檢測(cè)卻有很大局限性。湯富酬課題組首次開(kāi)發(fā)了基于三代單分子測(cè)序平臺(tái)的單細(xì)胞基因組測(cè)序方法SMOOTH-seq，其平均測(cè)序讀長(zhǎng)6000bp（相比于二代測(cè)序的300bp讀長(zhǎng)增加了20倍），從91個(gè)K562單細(xì)胞中檢測(cè)到4,790 個(gè)缺失事件和 5,589個(gè)插入事件, 其中87%的缺失片段和 91% 的插入片段長(zhǎng)度小于1kb，檢測(cè)到的插入事件DNA片段最長(zhǎng)達(dá)到 7.7kb（Fan et al., 2021）。其三、單分子納米孔測(cè)序方法可以直接檢測(cè)DNA分子上的表觀修飾。三個(gè)研究小組最近報(bào)道了基于三代單分子測(cè)序平臺(tái)的染色質(zhì)可及性測(cè)序方法（SMAC-seq, Fiber-seq和nanoNOMe）。盡管尚未到單細(xì)胞水平，但這些技術(shù)展示了研究長(zhǎng)距離相鄰基因組區(qū)域的協(xié)同調(diào)控關(guān)系的巨大潛力和廣闊應(yīng)用前景。

圖1 基于第三代單分子長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序平臺(tái)的單細(xì)胞多組學(xué)。紅色與綠色表示已經(jīng)實(shí)現(xiàn)的檢測(cè)，其中紅色表示基于三代長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序平臺(tái)的單細(xì)胞多組學(xué)方法，與基于二代短讀長(zhǎng)測(cè)序平臺(tái)的方法相比所具有優(yōu)勢(shì)的檢測(cè)方面

單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)序技術(shù)近年來(lái)進(jìn)展迅速，但是仍然有諸多可改進(jìn)之處。單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)序技術(shù)有很強(qiáng)的普適性。它具備高靈敏度和高精確度但仍有待加強(qiáng)。它的通量、自動(dòng)化和檢測(cè)速度近年來(lái)迅速提高且成本不斷下降，但是仍尚未達(dá)到臨床檢測(cè)的強(qiáng)勁需求。尤其對(duì)于人類在體干細(xì)胞研究，它的時(shí)空分辨率還有待大幅提高（圖2）。

圖2 單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)序技術(shù)的當(dāng)前狀態(tài)

湯富酬和文路為該論文的共同通訊作者。該研究項(xiàng)目得到了國(guó)家自然科學(xué)基金委、北京市科技委的支持。

來(lái)源：北京大學(xué)