細(xì)胞不對(duì)稱性（也稱細(xì)胞極性）廣泛存在于動(dòng)植物和微生物細(xì)胞中，其基本特征是母細(xì)胞在分裂前發(fā)生細(xì)胞極化，從而不對(duì)稱分裂生成兩個(gè)不同命運(yùn)的子代細(xì)胞。細(xì)胞極性是生命世界產(chǎn)生多樣性的根本原因，在細(xì)胞生長、增殖、分化、發(fā)育和行使細(xì)胞功能等方面發(fā)揮重要作用。細(xì)胞極性紊亂是某些腫瘤（如皮膚癌）發(fā)生的重要表現(xiàn)；微生物中，細(xì)胞極性會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞異質(zhì)性，造成病原菌抗性耐受（如結(jié)核分枝桿菌）、環(huán)境抵抗或宿主免疫逃逸等。

然而，由于細(xì)胞命運(yùn)決定調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的高度復(fù)雜性，關(guān)于細(xì)胞極性的認(rèn)知處于初級(jí)階段。細(xì)胞命運(yùn)決定蛋白如何實(shí)現(xiàn)時(shí)空有序的不對(duì)稱性亞細(xì)胞定位，是該領(lǐng)域有待深入解析的核心問題。微生物新月柄桿菌作為細(xì)胞不對(duì)稱性分裂的精煉模型，在細(xì)胞極性研究中具有獨(dú)特優(yōu)勢。

近日，中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院趙國屏/趙維團(tuán)隊(duì)在《自然-通訊》上，發(fā)表了題為Phase separation modulates the assembly and dynamics of a polarity-related scaffold-signaling hub的研究成果。該研究發(fā)現(xiàn)腳手架蛋白通過相分離形成具有細(xì)胞命運(yùn)決定功能的極性無膜區(qū)室，揭示了微生物細(xì)胞極性構(gòu)建和動(dòng)態(tài)調(diào)控的新機(jī)制。

腳手架蛋白廣泛存在于細(xì)胞中，通常能自組裝形成大分子復(fù)合物并將客戶蛋白招募至特定的細(xì)胞區(qū)域，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分裂、形態(tài)發(fā)生和不對(duì)稱分裂等生物過程中發(fā)揮作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在果蠅和隱桿線蟲中，Par蛋白可以通過相分離形成無膜區(qū)室，使下游信號(hào)蛋白（如αPKC或PKC3）不對(duì)稱定位和分布，從而保證胚胎發(fā)育正常進(jìn)行。這引起了科研團(tuán)隊(duì)對(duì)微生物腳手架蛋白可能通過發(fā)生相分離來調(diào)控細(xì)胞極性的思考。

研究團(tuán)隊(duì)以細(xì)胞發(fā)育模式微生物——新月柄桿菌為研究對(duì)象。在每個(gè)細(xì)胞周期中，新月柄桿菌可不對(duì)稱性分裂產(chǎn)生一個(gè)帶鞭毛的游動(dòng)子細(xì)胞和一個(gè)有柄子細(xì)胞（圖1）。在細(xì)胞分裂前，一對(duì)細(xì)胞命運(yùn)決定蛋白（磷酸化酶PleC和蛋白激酶DivJ）的極性定位協(xié)同調(diào)節(jié)多個(gè)下游信號(hào)蛋白的磷酸化水平，并決定新月柄桿菌的細(xì)胞命運(yùn)。已有研究表明，蛋白激酶DivJ通過PopZ和SpmX這一對(duì)腳手架蛋白復(fù)合物被招募到舊細(xì)胞極。而前期研究發(fā)現(xiàn)磷酸化酶PleC被一個(gè)潛在的腳手架蛋白PodJ定位到新細(xì)胞極。然而，微生物腳手架蛋白如何招募細(xì)胞命運(yùn)決定因子進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞極性的作用機(jī)制尚不清楚。為此，該團(tuán)隊(duì)以PodJ蛋白為中心，在新月柄桿菌中開展了細(xì)胞極性建立和調(diào)控機(jī)制的研究。

科研人員通過活細(xì)胞延時(shí)攝影證實(shí)了PodJ的細(xì)胞極定位模式——PodJ特異性地識(shí)別并聚集在新月柄桿菌的細(xì)胞新極。同時(shí)，PodJ能夠在“遠(yuǎn)親”大腸桿菌中表達(dá)并進(jìn)行細(xì)胞極性定位。研究分析蛋白聚態(tài)特征發(fā)現(xiàn)，該蛋白可以在體外自發(fā)形成大分子的高聚物。同時(shí)，PodJ在新月柄桿菌和大腸桿菌中的極性聚集均不依賴其他腳手架蛋白，表明該蛋白是一種能自組裝的腳手架蛋白。

通過PodJ蛋白序列分析，研究預(yù)測PodJ具有典型的內(nèi)在無序蛋白序列（Intrinsically Disordered Region，IDR）和串聯(lián)重復(fù)序列，暗示了該蛋白發(fā)生相分離的潛在可能。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源生理蛋白水平的PodJ可在體外自發(fā)形成微米大小的球形液滴。同時(shí)，PodJ在細(xì)胞內(nèi)也可形成具有典型流動(dòng)性液滴性質(zhì)的蛋白凝聚體（圖2），說明其在體內(nèi)外均可發(fā)生相分離。

通過大腸桿菌異源共表達(dá)平臺(tái)，研究團(tuán)隊(duì)在23個(gè)新月柄桿菌細(xì)胞周期或極性相關(guān)蛋白中篩選出兩個(gè)新的被PodJ所招募的細(xì)胞信號(hào)蛋白，即纖毛蛋白CpaE和鞭毛蛋白FliG。新月柄桿菌的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)表明，PodJ對(duì)PleC、CpaE和FliG等細(xì)胞信號(hào)功能蛋白的特異性招募均發(fā)生在細(xì)胞新極（圖3）。這說明腳手架蛋白PodJ可能通過相分離實(shí)現(xiàn)細(xì)胞區(qū)室化，并招募細(xì)胞新極相關(guān)的信號(hào)功能蛋白。

進(jìn)一步，科研團(tuán)隊(duì)對(duì)PodJ蛋白的結(jié)構(gòu)和功能域進(jìn)行深入挖掘和表征。研究發(fā)現(xiàn)，PodJ蛋白的IDR和CC4-6兩個(gè)結(jié)構(gòu)域都可以介導(dǎo)體外相分離發(fā)生。為了更好地剖析體內(nèi)PodJ相分離的結(jié)構(gòu)域，研究團(tuán)隊(duì)在大腸桿菌中表達(dá)多個(gè)PodJ蛋白變體，觀察其在細(xì)胞內(nèi)的蛋白定位和積累情況，并使用FRAP分析其流動(dòng)性。結(jié)果顯示，僅有CC4-6能夠形成細(xì)胞區(qū)室化并展現(xiàn)出一定的流動(dòng)性。這說明CC4-6或IDR均可在體外驅(qū)動(dòng)PodJ相分離，而在細(xì)胞內(nèi)，PodJ相分離可能依賴CC4-6和IDR共同發(fā)揮作用。研究通過在大腸桿菌中共表達(dá)信號(hào)功能蛋白和PodJ變體蛋白發(fā)現(xiàn)，IDR負(fù)責(zé)PleC和CpaE的招募，而CC4-6負(fù)責(zé)與FliG的相互作用。PodJ的體外相分離試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)（圖3）。這說明PodJ驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞區(qū)室化可能直接介導(dǎo)了對(duì)細(xì)胞信號(hào)功能蛋白的招募，從而在細(xì)胞新極的組織和構(gòu)建過程中發(fā)揮作用。

在真核細(xì)胞中，不對(duì)稱分配復(fù)合物之間往往存在相互的抑制性調(diào)節(jié)，這對(duì)于細(xì)胞極性的穩(wěn)態(tài)建立同樣重要。研究推測，原核細(xì)胞中的細(xì)胞極性調(diào)控可能也存在類似機(jī)制。為此，研究團(tuán)隊(duì)在11個(gè)新月柄桿菌極性蛋白中篩選到一個(gè)細(xì)胞舊極腳手架蛋白SpmX，發(fā)現(xiàn)其調(diào)節(jié)了PodJ在大腸桿菌的極性積累。在新月柄桿菌中，SpmX的存在負(fù)調(diào)節(jié)了PodJ細(xì)胞區(qū)室化形成。研究進(jìn)一步在體外進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，SpmX可以直接抑制PodJ液滴的形成，并可以覆蓋在PodJ液滴的表面，從而抑制液滴的生長并加速液滴的老化，造成對(duì)PodJ凝聚體動(dòng)力學(xué)和穩(wěn)定性的損害（圖4）。上述體外和體內(nèi)觀察結(jié)果表明，新月柄桿菌的新、舊細(xì)胞極重塑可能是由SpmX對(duì)PodJ相分離的抑制性調(diào)控作用所驅(qū)動(dòng)。

該工作提出了新的微生物細(xì)胞極性構(gòu)建和動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制。這一機(jī)制涉及細(xì)菌新細(xì)胞極組裝以及新、舊細(xì)胞極重塑（圖5）。該研究闡述了天然蛋白通過相分離形成無膜區(qū)室的分子基礎(chǔ)，解析了細(xì)胞區(qū)室化的生理功能及動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，證實(shí)了相分離作為組裝微生物細(xì)胞極性樞紐和調(diào)節(jié)不對(duì)稱細(xì)胞分裂的關(guān)鍵作用。通過對(duì)比原核和真核細(xì)胞，研究預(yù)測相分離可能作為一種通用的生物物理機(jī)制在細(xì)胞極性發(fā)育過程發(fā)揮調(diào)控作用。同時(shí)，對(duì)于相分離及其互作組分進(jìn)行功能解析，有助于進(jìn)一步人工設(shè)計(jì)、合成相關(guān)元件，并為人工無膜細(xì)胞器和單細(xì)胞生命從頭合成的實(shí)現(xiàn)打下基礎(chǔ)。

研究工作得到國家自然科學(xué)基金、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、中科院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)、廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金委員會(huì)和深圳市合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院的支持。

論文鏈接

圖1.新月柄桿菌細(xì)胞周期

　　圖2.腳手架蛋白PodJ相分離。a、PodJ在體外發(fā)生相分離形成蛋白液滴；b、PodJ蛋白液滴的融合特性分析；c、PodJ蛋白液滴的流動(dòng)性分析；d、鹽離子濃度及蛋白濃度對(duì)PodJ相分離的影響；e-f、PodJ細(xì)胞內(nèi)發(fā)生相分離及流動(dòng)性分析。

　　圖3.PodJ細(xì)胞區(qū)室化的生理功能。a-b、在大腸桿菌中篩選與PodJ相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)蛋白；c、在新月柄桿菌中驗(yàn)證PodJ招募相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)蛋白；d、PodJ招募細(xì)胞信號(hào)蛋白模式圖；e、PodJ通過相分離招募細(xì)胞信號(hào)蛋白。

　　圖4.SpmX負(fù)調(diào)控PodJ相分離。a. 新月柄桿菌細(xì)胞新、舊極重構(gòu)示意圖；b. SpmX負(fù)調(diào)控PodJ細(xì)胞區(qū)室化；c. SpmX抑制PodJ相分離。

　　圖5.腳手架蛋白調(diào)控微生物細(xì)胞極性示意圖。a. PodJ結(jié)構(gòu)和功能域示意圖；b. PodJ相分離特征示意圖；c. PodJ和SpmX共同調(diào)節(jié)新月柄桿菌細(xì)胞極組織和形成。

來源： 深圳先進(jìn)技術(shù)研究院