在基因編輯領(lǐng)域，一種被稱為Cas3的I型CRISPR蛋白就像“吃豆人”一樣，能夠連續(xù)咀嚼核苷酸鏈，實(shí)現(xiàn)從幾百個(gè)堿基對到200 kb的有針對性大片段缺失。然而，由于缺乏分子相當(dāng)于四個(gè)彩色鬼魂的調(diào)控機(jī)制，Cas3的廣泛而單向的基因組編輯活性基本上是不受調(diào)控的。

密歇根大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)系助理教授Yan Zhang博士及其與康奈爾大學(xué)的合作者發(fā)現(xiàn)了兩種能夠“關(guān)閉”Cas3的抗CRISPR蛋白，為更安全、更可控的CRISPR應(yīng)用鋪平了道路。

這項(xiàng)研究成果發(fā)表在《分子細(xì)胞》雜志上，題為《利用I-C型CRISPR-Cas3中的激活和失活機(jī)制進(jìn)行基因編輯應(yīng)用》。

生物技術(shù)應(yīng)用中的抗CRISPR蛋白 某些噬菌體進(jìn)化出小的抑制蛋白，被稱為抗CRISPR，以使細(xì)菌失活CRISPR效應(yīng)器進(jìn)行免疫防御。

研究人員已經(jīng)利用抗CRISPR（Acrs）蛋白來失活Cas9，一種II型CRISPR系統(tǒng)，以改變基因編輯活動的時(shí)機(jī)、位置或組織特異性擴(kuò)散，或減少不需要的離靶事件的數(shù)量。

抗Cas9核酸酶的Acrs提供了在許多應(yīng)用背景下控制基因編輯的可編碼剎車。例如，在Cas9 RNP傳遞后延遲引入AcrIIA4可以減少人類細(xì)胞中的離靶編輯。組織特異性的Acr表達(dá)控制了在小鼠的靶器官中安全進(jìn)行體內(nèi)Cas9編輯。Acrs還被用作基因驅(qū)動器的安全控制，生物傳感器和合成基因電路的促進(jìn)因子，噬菌體療法的促進(jìn)因子，并用于捕獲配體以定量測定體外Cas9的存在。

盡管CRISPR-Cas9可以通過使用兩個(gè)稱為單導(dǎo)RNA（sgRNA）的靶向RNA誘導(dǎo)大基因組缺失，這兩個(gè)sgRNA包圍要刪除的區(qū)域，但Cas9與兩個(gè)sgRNA可能增加不希望的離靶突變的機(jī)會，以及在切割位點(diǎn)之間發(fā)生意外的逆突變。

調(diào)控Cas3介導(dǎo)的基因組缺失 CRISPR-Cas3是一種I型CRISPR系統(tǒng)，依賴于一個(gè)稱為CRISPR相關(guān)復(fù)合物（Cascade）的多亞基核糖核蛋白復(fù)合物（RNP）來促進(jìn)DNA目標(biāo)搜索，并在與目標(biāo)DNA形成復(fù)合物時(shí)激活。盡管I型CRISPR啟用的真核應(yīng)用不斷增加，但尚未開發(fā)出Acr關(guān)閉開關(guān)來控制這些技術(shù)。

通過比較和分析幾個(gè)Cascade-Cas3復(fù)合物的冷凍電子顯微鏡“快照”，張研究組以高分辨率揭示了結(jié)合和切割機(jī)制。在這一結(jié)構(gòu)證據(jù)的基礎(chǔ)上，他們確定了兩種高效的抗CRISPR蛋白，AcrIC8和AcrIC9，通過兩種略有不同的機(jī)制阻止Cascade與DNA靶標(biāo)結(jié)合。重要的是，在人類基因編輯實(shí)驗(yàn)中，這兩種Acr都顯示出抑制Cascade-Cas3誘導(dǎo)的DNA缺失和Cascade與P65轉(zhuǎn)錄激活子結(jié)構(gòu)域融合介導(dǎo)的基因激活。

AcrIC8和AcrIC9代表了第一套作為多亞基CRISPR基因編輯器關(guān)閉開關(guān)的Acrs，為更安全、更可控的I型CRISPR應(yīng)用鋪平了道路。這為通過時(shí)間、空間、組織特異性以及光或藥物控制的Acr調(diào)控改善I型基因編輯結(jié)果奠定了基礎(chǔ)。AcrIC8和AcrIC9的劑量依賴性反應(yīng)可能允許可調(diào)控的控制，而不僅僅是一個(gè)簡單的開關(guān)。

盡管Acr蛋白作為Cas效應(yīng)器的關(guān)閉開關(guān)具有巨大的前景，但張博士及其同事表示，不太可能找到對廣泛的CRISPR-Cas系統(tǒng)高度有效的Acrs，因?yàn)镃as同源體之間的結(jié)構(gòu)變異可能削弱Acr的高親和力相互作用。狹譜Acr可能允許對一個(gè)CRISPR變體的控制，而不干擾其他變體，而廣譜Acr可以保護(hù)整個(gè)生物體免受所有編輯劑的潛在活性。因此，了解每個(gè)Acr對不同CRISPR系統(tǒng)的交叉反應(yīng)至關(guān)重要。

參考文獻(xiàn)：http://dx.doi.org/10.1038/s41598-023-50138-9

編輯：周敏

排版：李麗