一種名為PRINT的基于RNA的系統(tǒng)可以在人類基因組中創(chuàng)建并引入特定位置的安全且穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因。僅使用兩種體外轉(zhuǎn)錄的RNA，即“precise RNA-mediated insertion of transgenes”（PRINT），該系統(tǒng)通過(guò)位點(diǎn)特異性引導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄，將轉(zhuǎn)基因直接合成到基因組的多拷貝安全區(qū)位點(diǎn)。這種基于RNA的策略可以降低有害的免疫反應(yīng)，防范來(lái)自外源DNA的隨機(jī)基因組插入，適用于基因療法等用途，而且成本相對(duì)較低，生產(chǎn)迅速且可擴(kuò)展。

研究論文《利用真核反轉(zhuǎn)座元件蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)基因插入人類安全區(qū)位點(diǎn)》“Harnessing eukaryotic retroelement proteins for transgene insertion into human safe-harbor loci”?發(fā)表在《Nature Biotechnology》雜志上。

基于RNA的轉(zhuǎn)基因技術(shù) 一些非長(zhǎng)末端重復(fù)（non-LTR）的反轉(zhuǎn)座元件利用RNA模板進(jìn)行新基因合成，通過(guò)目標(biāo)引導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄（TPRT）將合成的互補(bǔ)DNA（cDNA）直接插入基因組，而不生成易于發(fā)生突變重連的鈍端雙鏈末端。

加州大學(xué)伯克利分校的共同主要作者張曉竹和Briana Van Treeck采用一種方法，利用編碼鳥(niǎo)類R2反轉(zhuǎn)座元件和經(jīng)驗(yàn)證長(zhǎng)度可達(dá)4kb的轉(zhuǎn)基因的RNA。R2蛋白協(xié)調(diào)地識(shí)別目標(biāo)位點(diǎn)，在精確的位置切割一個(gè)鏈條，并為穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因插入啟動(dòng)互補(bǔ)DNA合成。

PRINT專門插入多拷貝的核糖體RNA基因位點(diǎn)（rDNA），該基因由RNA聚合酶（RNAP）轉(zhuǎn)錄，已用于長(zhǎng)期表達(dá)轉(zhuǎn)基因。由于目標(biāo)序列位于每個(gè)基因組中數(shù)百個(gè)拷貝中，而在人類細(xì)胞中這些拷貝以串聯(lián)陣列形式存在于五對(duì)acrocentric染色體的短臂上，細(xì)胞功能不會(huì)受到幾個(gè)rDNA單位被插入元件導(dǎo)致的失活的妨礙。

在對(duì)培養(yǎng)的人類原代細(xì)胞系使用PRINT時(shí)，張和Van Treeck報(bào)告說(shuō)，超過(guò)50%的細(xì)胞可以獲得幾個(gè)2kb的轉(zhuǎn)基因，其中超過(guò)50%是全長(zhǎng)的。離靶事件和cDNA合成錯(cuò)誤非常罕見(jiàn)，每大約10,000bp僅檢測(cè)到一個(gè)錯(cuò)誤，與RNA和cDNA合成的預(yù)期保真度一致。

盡管上述結(jié)果構(gòu)成了一種基于兩種體外轉(zhuǎn)錄的RNA的遞補(bǔ)人類基因組的傳遞方法的原理證明，但對(duì)于PRINT發(fā)展仍需解決關(guān)鍵的知識(shí)差距和方向。例如，監(jiān)測(cè)和減少對(duì)引入RNA的不良細(xì)胞反應(yīng)將是至關(guān)重要的，需要在與疾病治療相關(guān)的背景下調(diào)查長(zhǎng)期轉(zhuǎn)基因存在，以及需要研究和了解PRINT在包括非分裂細(xì)胞在內(nèi)的各種細(xì)胞類型中的效率。

作者建議，如果PRINT最終發(fā)展成為一種基因治療方法，它將是CRISPR–Cas基于基因破壞、堿基編輯和序列替代的補(bǔ)充，后者使用引導(dǎo)RNA將DNA合成和修復(fù)機(jī)制帶到內(nèi)源基因位點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：https://www.nature.com/articles/s41587-024-02137-y

編輯：王洪

排版：李麗