一、課程內(nèi)容

第一天

蛋白質(zhì)結晶前準備

課程介紹和蛋白質(zhì)結構功能基本介紹

提純蛋白質(zhì),確定濃度、pH值、緩沖液等條件,控制蛋白質(zhì)穩(wěn)定性等。

1、目的蛋白質(zhì)信息檢索與調(diào)查

– 利用生物信息學工具搜集目標蛋白質(zhì)的基因序列、結構域、同源蛋白質(zhì)的信息

– 分析目標蛋白質(zhì)的理化性質(zhì),如分子量、等電點、聚合程度、穩(wěn)定性等

2、質(zhì)粒制備

– 設計引物,克隆目標基因到表達載體

– 轉化表達宿主,提取重組質(zhì)粒

– 質(zhì)粒測序等驗證目標基因插入

3、蛋白質(zhì)純化

– 選擇合適的誘導表達等條件,表達可溶性或不溶性重組蛋白

– 裂解菌體,釋放重組蛋白質(zhì)

– 蛋白質(zhì)純化:親和層析、離子交換層析、凝膠過濾等層析技術的原理和實踐等

4、蛋白質(zhì)不表達和包涵體問題

– 分析不表達的原因,優(yōu)化誘導條件

– 改進溶解緩沖液條件,提高蛋白從包涵體中釋放

5、蛋白質(zhì)活性鑒定

– 進行Western Blot或酶活性實驗驗證蛋白質(zhì)活性

6、蛋白質(zhì)結晶前分析

– 測定蛋白質(zhì)的純度、聚合狀態(tài)、穩(wěn)定性等

– 優(yōu)化緩沖液條件,調(diào)整蛋白質(zhì)到適宜的pH和離子濃度等

第二天

蛋白質(zhì)結晶與衍射數(shù)據(jù)收集

利用協(xié)同結晶篩選獲得蛋白質(zhì)結晶,在同步輻射光源下收集衍射數(shù)據(jù)。

1、蛋白質(zhì)結晶

– 蛋白質(zhì)結晶的基本原理

– 蛋白質(zhì)結晶的影響因素

– 蛋白質(zhì)結晶的基本方法

– 結晶條件篩選策略- 結晶條件篩選策略

– 沒有晶體或者改善晶體質(zhì)量的策略

– 晶體后處理

– 晶體凍存的基本原理和策略

2、SSRF（同步輻射光源） 的介紹

– SSRF簡介

– SSRF的光源優(yōu)勢

– SSRF的實驗站介紹

3、蛋白質(zhì)晶體衍射數(shù)據(jù)收集

– X射線結晶學基本原理

– 晶體探針和晶體定位

– 晶體測試和優(yōu)化

– 衍射數(shù)據(jù)收集參數(shù)設定和收集策略

– 衍射數(shù)據(jù)處理和分析

第三天

蛋白質(zhì)晶體結構解析軟件安裝

安裝相關計算機程序,如Phenix, XDS, Pymol等用于后續(xù)的數(shù)據(jù)處理與模型建立。

1、下載和安裝簡要介紹

2、蛋白質(zhì)晶體結構解析軟件安裝

– CCP4安裝

– Phenix安裝

– Coot安裝

– PyMol安裝

– 其他結構解析支持軟件安裝

依次介紹CCP4、Phenix、Coot、PyMol等主要的結構解析軟件的下載和安裝方法。也可以介紹一些結構解析中需要的其他軟件工具的安裝。

Index、integrate與scale & merge等軟件使用和介紹

利用軟件index及integrate衍射點,scale& merge等處理衍射數(shù)據(jù)以校正強度。

1、晶體結構學基礎知識

– 晶體學中的衍射理論基礎

– 布拉格定律和倒易空間

– 晶體的對稱性

2、蛋白質(zhì)晶體結構解析流程

– 蛋白質(zhì)的表達與純化

– 蛋白質(zhì)的結晶

– X射線晶體學數(shù)據(jù)收集

– 晶體結構解析流程概述

3、Index和integrate

– Indexing的目的和原理

– Integration的目的和過程

4、Scale & merge

– Scale & merge的目的——校正數(shù)據(jù)

– Scale& merge常用方法

5、使用Scala/XSCALE/Aimless等進行Scale & merge

– Scala/XSCALE/Aimless等軟件介紹

– Scala/XSCALE/Aimless進行數(shù)據(jù)scale& merge的步驟

6、使用HKL2000進行index、integrate和scale & merge

– HKL2000軟件介紹

– 使用HKL2000進行indexing

– 使用HKL2000進行integration

– 使用HKL2000進行scaling & merge

第四天

相位解析、電子密度重構、分子結構模型構建修正和優(yōu)化與結構提交

利用直接法/分子置換法/M(S)AD/M(S)IR 等等相位解析方法確定蛋白質(zhì)框架,手動模型構建余下結構,進行修正和優(yōu)化后達到標準后提交蛋白質(zhì)坐標庫。

1、 直接法/分子置換法/M(S)AD/M(S)IR 等方法解析相位

（1）直接法/分子置換法/M(S)AD/M(S)IR等的基本原理

(2) 直接法/分子置換法/M(S)AD/M(S)IR等的目的

(3) 常用的軟件介紹

(4) 直接法/分子置換法/M(S)AD/M(S)IR等的具體操作步驟

2．電子密度修飾：

（1）電子密度修飾的基本原理：

（2）電子密度修飾的目的

（3）電子密度修飾的常用軟件介紹

（4）電子密度修飾的具體操作步驟

3．電子密度重構

（1）電子密度重構的目的和基本原理

（2）電子密度重構的操作

4、蛋白質(zhì)晶體結構模型構建

(1) 蛋白質(zhì)序列比對確定構建起始模型

(2) 主鏈構建方法

(3) 側鏈構建方法

(4) 構建完成后的模型檢查

5、蛋白質(zhì)晶體結構修正與優(yōu)化

(1) 能量最小化原理

(2) 模擬退火原理

(3) 分子動力學模擬原理

(4) 優(yōu)化過程中的評估標準

（5）結構修正常用軟件介紹

（6）結構修證的具體操作步驟

6、蛋白質(zhì)晶體結構驗證

（1）結構驗證的目的和基本原理

(2) Ramachandran圖分析

(3) 各類鍵長和鍵角分布

(4) 密接點分析

(5) B因子分布

(6) 電子密度匹配度評價

（7）各種指標與統(tǒng)計數(shù)據(jù)

7、蛋白質(zhì)晶體結構提交到PDB

(1) PDB數(shù)據(jù)提交要求

(2) 各項驗證確認無誤后壓縮需提交文件

(3) 在PDB網(wǎng)站提交表單,上傳文件,等待審核結果，回復信息

第五天

蛋白質(zhì)晶體結構展示與分析 、結構與功能的關系

5.1 利用Pymol等軟件分析并展示蛋白質(zhì)的二級結構、三級結構,活性口袋等結構信息。

1、pdb格式文件簡介

– pdb文件概述:包含蛋白質(zhì)晶體學數(shù)據(jù)的標準格式

– 原子坐標:記錄每個原子的xyz坐標

– 溫度因子:記錄每個原子的熱運動參數(shù)

– 二級結構:記錄α螺旋和β片層的位置

– 結構注解:記錄配體、酶活性中心等重要結構信息

2、PyMOL制作蛋白質(zhì)晶體結構圖

– PyMOL簡介:流行的分子可視化軟件

– 加載pdb文件

– 顯示蛋白質(zhì)鏈、α螺旋和β片層

– 調(diào)整視角、變色和放大關鍵結構

– 導出高質(zhì)量圖像3、使用PyMOL制作蛋白質(zhì)配體結合位點信息

– 識別蛋白質(zhì)與配體的相互作用

– 突出顯示配體結合位點殘基

– 在結合位點生成表面模型

– 制作配體結合位點的特寫圖

4、使用PyMOL調(diào)查蛋白質(zhì)的溫度因子B-factors

– 顯示溫度因子putty圖

– 分析柔性域和穩(wěn)定域

– 與酶活性中心和功能位點的關系

5、使用PyMOL重疊對比不同的蛋白質(zhì)晶體結構

– 載入不同狀態(tài)的pdb文件

– 重疊對齊蛋白質(zhì)結構

– 比較構象變化,如酶動力學過程中的不同中間狀態(tài)6、使用PyMOL顯示蛋白質(zhì)晶體結構中配體的電子密度圖

– 加載包含配體密度的pdb文件

– 顯示2Fo-Fc 和 Fo-Fc電子密度圖

– 檢查配體與電子密度的匹配程度

– 評估配體定位和取向的準確性7、使用PyMOL結合Chimera實現(xiàn)同步顯示非對稱單元的蛋白質(zhì)分子

– 在PyMOL中顯示蛋白質(zhì)非對稱單元

– 在Chimera中同步顯示非對稱單元

– 細節(jié)對比不同分子中的相同結構

– 分析蛋白質(zhì)多聚體形成的分子間相互作用

5.2 生物大分子結構介紹

5.3 結構與功能關系：

（1）如何分析結構與功能關系：

（2）分析結構的目的：

（3）結構與功能關系的研究手段：

（4）結構能帶來什么？