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重磅丨銳博外泌體miRNA-seq和Agomir助力心臟保護(hù)運(yùn)動(dòng)因子發(fā)現(xiàn)-肽度TIMEDOO

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練除了降低心血管危險(xiǎn)因素外，可直接預(yù)防心肌缺血/再灌注（MI/R）損傷，還與提高人類心臟病發(fā)作存活率有關(guān)。然而，運(yùn)動(dòng)所提供的心臟保護(hù)的潛在機(jī)制仍不清楚。研究表明運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的循環(huán)外泌體可能對(duì)心血管具有重要益處，為了揭示運(yùn)動(dòng)衍生的循環(huán)外泌體在心臟保護(hù)中的作用及其分子機(jī)制，第四軍醫(yī)大學(xué)高峰、王立峰課題組在Circulation Research（影響因子：15.211）上發(fā)表了題為Longterm Exercise-Derived Exosomal miR-342-5p的重要成果。該研究揭示了一種新的內(nèi)源性心臟保護(hù)機(jī)制：長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)衍生的循環(huán)外泌體通過(guò)外泌體miR-342-5p保護(hù)心臟免受心肌缺血/再灌注損傷。

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1、四周游泳訓(xùn)練保護(hù)大鼠心臟免受MI/R損傷

研究人員對(duì)一組大鼠進(jìn)行游泳訓(xùn)練，每天2次，持續(xù)進(jìn)行4周。在最后一次訓(xùn)練24小時(shí)后，大鼠心肌缺血30分鐘后再灌注24小時(shí)。發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)組大鼠表現(xiàn)出心肌梗死面積的減小和血清乳酸脫氫酶(LDH)水平的降低（乳酸脫氫酶主要存在于心肌細(xì)胞中，乳酸脫氫酶水平偏高，可以作為心肌受損的指標(biāo)），表明4周的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可提供防止MI/R損傷的心肌保護(hù)。

2、長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)的大鼠和人類血漿外泌體的表征和體外功能驗(yàn)證

最后一次訓(xùn)練24小時(shí)后，分離運(yùn)動(dòng)大鼠(Exe-exo)和久坐大鼠(Sed-exo)血漿中的外泌體。電鏡分析顯示直徑為30-100nm的典型圓形顆粒，Western blot證實(shí)外泌體標(biāo)記蛋白（TSG101和CD81）的存在，并顯示Sed-exo和Exe-exo之間沒(méi)有顯著的差異。然后將這兩種外泌體分別與受損的心肌細(xì)胞共孵育，發(fā)現(xiàn)Exe-exo預(yù)孵育48小時(shí)后，H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷減弱，如心肌細(xì)胞凋亡和LDH釋放減少，而Sed-exo卻沒(méi)有這種效果。

然后研究人員檢查了運(yùn)動(dòng)對(duì)人體循環(huán)外泌體的影響。招募了16名健康男學(xué)生運(yùn)動(dòng)員，讓他們進(jìn)行1年以上的賽艇訓(xùn)練（每天訓(xùn)練1-2小時(shí)，每周6天）；同時(shí)招募16名未經(jīng)訓(xùn)練的男性對(duì)照學(xué)生。最后一次訓(xùn)練課程24小時(shí)后采集血樣，收集賽艇運(yùn)動(dòng)員（Row-exo）或?qū)φ諏W(xué)生（Con-exo）血漿中的外泌體。同樣地，發(fā)現(xiàn)Row-exo預(yù)孵育減少了心肌細(xì)胞凋亡和LDH釋放并增加了心肌細(xì)胞活力。這些結(jié)果表明：運(yùn)動(dòng)衍生的血漿外泌體對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

3、心肌內(nèi)遞送運(yùn)動(dòng)衍生的循環(huán)外泌體可減少M(fèi)I/R后的梗死面積并改善心功能

為了確定體內(nèi)Exe-exo的心臟保護(hù)作用，將Exe-exo或 Sed-exo通過(guò)心肌內(nèi)注射到大鼠中，48h后再進(jìn)行MI/R。與對(duì)照大鼠相比，Exe-exo處理的大鼠表現(xiàn)出梗死面積的顯著減小，并伴隨著血清LDH的降低和心臟功能的改善。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明了Exe-exo對(duì)MI/R損傷具有心臟保護(hù)作用。

4、miR-342-5p是Exe-exo誘導(dǎo)的心臟保護(hù)作用的關(guān)鍵組分

為了探討miRNA(s)是否參與了Exe-exo誘導(dǎo)的心臟保護(hù)作用，研究人員通過(guò)miRNA-seq（外泌體miRNA建庫(kù)、miRNA-seq服務(wù)由銳博生物提供）和qRT-PCR驗(yàn)證在Exe-exo和Sed-exo中鑒定了12個(gè)差異表達(dá)的miRNAs。其中miR-342-5p是最有效的心臟保護(hù)分子，可顯著降低H/R作用下心肌細(xì)胞的凋亡，降低LDH的釋放，并增加細(xì)胞活力。并且發(fā)現(xiàn)學(xué)生運(yùn)動(dòng)員體內(nèi)的外泌體miR-342-5p水平比未經(jīng)訓(xùn)練的對(duì)照組學(xué)生更高。

為了更好地理解外泌體miR-342-5p的功能，研究人員檢測(cè)了miR-342-5p及其前體在血漿外泌體處理的心肌細(xì)胞和心臟中的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)miR-342-5p水平在Exe-exo處理的心肌細(xì)胞和心臟中顯著升高，而pre-miR-342-5p水平?jīng)]有顯著變化，表明Exe-exo是將miR-342-5p遞送至心肌細(xì)胞或心臟。此外，miR-342-5p的抑制顯著減弱了運(yùn)動(dòng)衍生的血漿外泌體的保護(hù)作用。表明miR-342-5p在Exe-exo誘導(dǎo)的心臟保護(hù)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

5、miR-342-5p通過(guò)靶向心肌細(xì)胞中的Caspase 9和Jnk2發(fā)揮抗凋亡作用

研究人員通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了miR-342-5p可能的靶基因，最后重點(diǎn)關(guān)注參與缺血/再灌注損傷和凋亡途徑的Caspase 3、Caspase 9 和Jnk2。研究發(fā)現(xiàn)miR-342-5p mimic/inhibitor可顯著減低/增加心肌細(xì)胞中Caspase 9和Jnk2蛋白水平，Caspase 3的表達(dá)則無(wú)顯著變化。螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了Caspase 9和Jnk2的3’UTR中miR-342-5p的結(jié)合位點(diǎn)。此外，miR-342-5p mimic與心肌細(xì)胞預(yù)孵育顯著抑制了H/R誘導(dǎo)的裂解的Caspase 3、裂解的Caspase 9和磷酸化(p-Jnk2 (Thr183/Tyr185)的增加。這些結(jié)果表明miR-342-5p通過(guò)靶向心肌細(xì)胞中的Caspase9和Jnk2發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用。

6、miR-342-5p通過(guò)靶向Ppm1f增強(qiáng)心肌細(xì)胞Akt的磷酸化

生存信號(hào)Akt和Erk1/2作為心臟保護(hù)的關(guān)鍵分子已被廣泛報(bào)道。miR-342-5p mimic/inhibitor可提高/降低心肌細(xì)胞中Akt的磷酸化水平，而Erk1/2的磷酸化沒(méi)有顯著變化。在H/R處理的心肌細(xì)胞中也觀察到類似的結(jié)果。表明miR-342-5p可以激活心肌細(xì)胞中的促存活信號(hào)Akt。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)Ppm1f是miR-342-5p潛在靶點(diǎn)中唯一的磷酸酶。miR-342-5p mimic/inhibitor可降低/增加心肌細(xì)胞中Ppm1f蛋白水平。螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步證實(shí)了miR-342-5p直接靶向Ppm1f 3’UTR。值得注意的是，通過(guò)siRNA沉默下調(diào)Ppm1f蛋白表達(dá)不僅顯著提高了Akt磷酸化水平，而且還降低了由H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，表明Akt磷酸化水平升高可能在miR-342-5p提供的心臟保護(hù)中發(fā)揮作用。

7、內(nèi)皮細(xì)胞是運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的外泌體miR-342-5p的主要來(lái)源

為了探索長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致循環(huán)外泌體miR-342-5p增加的來(lái)源，研究人員檢測(cè)了miR-342-5p在大鼠不同部位中的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)成熟miR-342-5p在多個(gè)組織中表達(dá)。經(jīng)過(guò)4周游泳訓(xùn)練，這些組織中miR-342-5p表達(dá)顯著升高，而這是由主動(dòng)脈所導(dǎo)致的。進(jìn)一步研究表明，主動(dòng)脈內(nèi)皮的去除顯著降低了運(yùn)動(dòng)大鼠主動(dòng)脈中miR-342-5p水平，提示內(nèi)皮細(xì)胞是主動(dòng)脈中miR-342-5p的主要來(lái)源。研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)也顯著增加了內(nèi)皮細(xì)胞中miR-342-5p表達(dá)。此外，電鏡鑒定了內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中存在典型的多泡體(MVBs)，MVBs與質(zhì)膜融合可釋放腔內(nèi)外泌體進(jìn)入循環(huán)。表明血管內(nèi)皮細(xì)胞是運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)循環(huán)外體miR-342-5p升高的重要來(lái)源。

接下來(lái)，為了研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞釋放的外泌體是否能被心肌細(xì)胞攝取。研究人員從轉(zhuǎn)染了Cy3標(biāo)記的miRNA的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)條件培養(yǎng)基中分離出外泌體，然后加入到培養(yǎng)的人心肌細(xì)胞中。共聚焦成像證實(shí)了外泌體Cy3標(biāo)記的miRNA從內(nèi)皮細(xì)胞向心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)，miR-342-5p在受體心肌細(xì)胞中的表達(dá)增加。更重要的是，受體心肌細(xì)胞在H/R后凋亡減少。這些結(jié)果表明內(nèi)皮細(xì)胞釋放含有miR-342-5p的外泌體不僅能被心肌細(xì)胞所吸收，還能保護(hù)心肌細(xì)胞免受H/R損傷。

8、miR-342-5p在體內(nèi)長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的心臟保護(hù)中必不可少

為了探討miR-342-5p在體內(nèi)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的心臟保護(hù)中的作用，研究人員在大鼠游泳訓(xùn)練前一周通過(guò)心肌內(nèi)注射AAV-anti-miR-342-5p或aav-陰性對(duì)照。發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可增加心臟miR-342-5p，同時(shí)降低心肌Caspase 9、Jnk2和Ppm1f的表達(dá)，并且增加Akt磷酸化；AAV-anti-miR-342-5p處理可減弱這些變化。重要的是，在運(yùn)動(dòng)的MI/R大鼠中觀察到心肌梗塞面積和心肌細(xì)胞凋亡減少，這通過(guò)AAV-抗-miR-342-5p處理可顯著減弱這些變化。此外，在MI/R前48小時(shí)，miR-342-5p agomir（由銳博生物提供）治療顯著提高了大鼠心臟的miR-342-5p水平，并減少了心肌梗死面積。這些體內(nèi)數(shù)據(jù)表明miR-342-5p在長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的心肌保護(hù)中對(duì)MI/R損傷具有重要作用。

原文：Hou Z, Qin X, Hu Y, et al. Longterm Exercise-Derived Exosomal miR-342-5p: A Novel Exerkine for Cardioprotection[J]. Circulation research, 2019.

來(lái)源：銳博生物

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