隨著新一代測(cè)序的出現(xiàn)，各種生物的遺傳數(shù)據(jù)呈指數(shù)級(jí)增長，但了解基因的序列數(shù)據(jù)，這顯然還不夠。為了讓遺傳數(shù)據(jù)真正派上用場(chǎng)，必須確定基因功能，并了解基因型與表型之間的關(guān)聯(lián)。功能基因組學(xué)就旨在闡明基因型與表型之間的關(guān)系。

經(jīng)典的方法是正向遺傳篩選，也就是對(duì)基因功能進(jìn)行修飾，并確定表型的變化。過去，正向篩選主要是依靠隨機(jī)突變和病毒轉(zhuǎn)座子來改變基因功能，但這些方法難以大規(guī)模開展。RNAi的出現(xiàn)讓研究人員能夠?qū)蚬δ荛_展靶向破壞。

過去十幾年，RNAi一直是功能基因組學(xué)篩選的首選方法，但橫空出世的CRISPR-Cas9似乎搶了RNAi的不少風(fēng)頭。在這里，我們就來比較一下RNAi和CRISPR-Cas9在篩選基因功能上的應(yīng)用。

RNAi帶來的基因沉默

人們?cè)缇陀^察到將雙鏈RNA（dsRNA）引入生物體會(huì)引起基因沉默，但直到1998年Fire和Mello發(fā)表線蟲的研究成果，這個(gè)機(jī)制才變得清晰，也有了RNA干擾（RNAi）這個(gè)術(shù)語。RNAi通過小分子RNA來調(diào)控基因表達(dá)，在細(xì)胞發(fā)育和免疫中起重要作用。

雙鏈RNA分子在內(nèi)源蛋白DICER和RISC的加工下成為單鏈RNA，靶向與其互補(bǔ)的mRNA轉(zhuǎn)錄本并使其降解，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后的蛋白質(zhì)水平降低。除了外源RNA，其他RNA分子也可以引發(fā)基因沉默，包括siRNA、miRNA和shRNA。

之后，RNAi被迅速用于各種細(xì)胞和生物體，一躍成為基因改造的首選方法。它僅需要短的干擾RNA（siRNA），就能引發(fā)基因功能的快速喪失。不過，利用siRNA來進(jìn)行全基因組篩選就比較麻煩，需要一個(gè)一個(gè)來評(píng)估。

于是，人們利用慢病毒載體將shRNA文庫導(dǎo)入細(xì)胞。shRNA隨機(jī)整合到基因組中，并穩(wěn)定表達(dá)，從而克服了siRNA的限制。這種方法讓每個(gè)細(xì)胞帶上“條形碼”，實(shí)現(xiàn)了混合形式的全基因組shRNA文庫篩選。它后來也應(yīng)用到CRISPR-Cas9篩選中。

CRISPR-Cas9需要將Cas9和sgRNA一起導(dǎo)入，而RNAi的機(jī)制在大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中是保守的，這是它的主要優(yōu)點(diǎn)。轉(zhuǎn)染siRNA仍然是最快速最簡(jiǎn)單的方法，能夠迅速引起表型變化。不過對(duì)于高通量的表型篩選而言，混合文庫更有吸引力，并且更經(jīng)濟(jì)。

惱人的脫靶效應(yīng)

RNAi和CRISPR-Cas9都有脫靶效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，可能導(dǎo)致假陽性，因?yàn)閟hRNA或sgRNA可靶向帶有互補(bǔ)種子區(qū)的序列，造成依賴序列的脫靶效應(yīng)。RNAi同時(shí)還表現(xiàn)出不依賴序列的脫靶活性，導(dǎo)致干擾素調(diào)節(jié)基因的上調(diào)和蛋白質(zhì)表達(dá)的改變。脫靶造成的基因沉默使人們很難鑒定和驗(yàn)證hits，對(duì)功能基因組篩選是不利的。

為了避免RNAi的序列依賴性脫靶效應(yīng)，人們通過生物信息學(xué)工具來精心挑選shRNA序列，并采用多個(gè)獨(dú)立的shRNA來靶向同一基因，以此來提高統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。目前，基于RNAi的正向篩選已經(jīng)獲得了可靠的數(shù)據(jù)集，但負(fù)向篩選仍受到高背景噪音的干擾。

在CRISPR-Cas9技術(shù)的早期也觀察到序列依賴性脫靶活性，以及sgRNA效率的差異。不過，設(shè)計(jì)工具的改進(jìn)在很大程度上減輕了這些的影響。如今，你可以借助多種算法來選擇最高效、最特異的向?qū)NA庫。與shRNA一樣，選擇多個(gè)sgRNA來靶向目的基因，可確認(rèn)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不過最近的一項(xiàng)研究表明，CRISPR-Cas9的脫靶效應(yīng)要低于RNAi。

knockdown vs. knockout

RNAi和CRISPR-Cas9之間的主要區(qū)別在于RNAi是通過靶向RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平降低或敲低基因表達(dá)；CRISPR-Cas9則是一種基因編輯工具，靶向DNA并永久改變或敲除基因表達(dá)。這兩個(gè)選項(xiàng)都很有用，具體要取決于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和待解決的問題。

某些情況下可能需要CRISPR-Cas9來完全敲除，以免殘留的低水平蛋白表達(dá)造成任何不確定的影響。對(duì)于具有多個(gè)基因拷貝的癌細(xì)胞系，它就很有用。當(dāng)然，在某些情況下敲低是更好的選擇。例如，必需基因的敲除是致死的，導(dǎo)致細(xì)胞難以研究。敲低則可以更好地模擬藥物對(duì)靶點(diǎn)的抑制。

隨著CRISPR-Cas9工具箱的擴(kuò)大，人們的選擇不僅僅限于CRISPR-Cas9和RNAi。將催化失活的Cas9（dCas9）與轉(zhuǎn)錄抑制因子相連接，現(xiàn)在也可以實(shí)現(xiàn)CRISPR介導(dǎo)的敲低。CRISPR干擾篩選（CRISPRi）將RNAi的敲低功能與CRISPR的高效特異相結(jié)合，應(yīng)用于功能基因組篩選。

shRNA vs. sgRNA

CRISPR-Cas9技術(shù)的快速發(fā)展，遞送載體和sgRNA設(shè)計(jì)的改進(jìn)，以及CRISPR衍生技術(shù)的出現(xiàn)（包括CRISPRi、CRISPRa、堿基編輯、表觀基因組編輯）將人們從RNAi中吸引過來。CRISPR基因敲除的效率以及高特異性和低背景，與RNAi形成了鮮明對(duì)比。RNAi的優(yōu)勢(shì)在于依靠?jī)?nèi)源性RNA沉默機(jī)制，因此在操作上是最簡(jiǎn)單的方法。

如今，多功能的CRISPR技術(shù)讓一系列的基因修飾（CRISPR-KO、CRISPRi和CRISPRa）得以實(shí)現(xiàn)。因此，它已取代RNAi成為首選的功能基因組篩選工具。

來源：生物通