2020年11月27日，清華大學結構生物學高精尖創(chuàng)新中心主任施一公教授研究組就剪接體的機理與結構研究，于《科學》（Science）雜志以長文形式再次發(fā)表重大研究成果（圖1）。這篇題為《ATP水解酶/解旋酶Prp2及其激活因子Spp2催化剪接體激活過程中結構重塑的分子機理》（Mechanism of Spliceosome Remodeling by the ATPase/helicase Prp2 and its Coactivator Spp2）的論文報道了釀酒酵母處于激活狀態(tài)的剪接體（activated spliceosome，定義為“Bact復合物”）2.5埃的高分辨率電鏡結構，此外還解析了ATP水解酶/解旋酶Prp2處于游離狀態(tài)以及Prp2與其激活因子Spp2復合物的電鏡結構。該結構是目前報道的最高分辨率的剪接體結構，首次展示了剪接體狀態(tài)轉變過程中的“動力驅動”蛋白——ATP水解酶/解旋酶Prp2及其激活因子Spp2催化其重塑的結構基礎，并結合大量生化實驗，闡明了Prp2在前體信使RNA上單向移動的分子機理，回答了Spp2如何通過將Prp2錨定在剪接體上輔助其發(fā)揮重塑剪接體的功能等一系列重要科學問題。1977年，科學家們首次發(fā)現(xiàn)來自于腺病毒的mRNA與其對應的DNA轉錄模板并不能形成連續(xù)的雜交雙鏈，而是在雜交雙鏈的不同位置伸出了環(huán)狀的DNA單鏈。這個重大發(fā)現(xiàn)表明，遺傳信息從DNA傳遞到mRNA上并不只是通過轉錄，還需要pre-mRNA剪接來進一步完成“無效”遺傳信息的去除與有效遺傳信息的拼接。不能被翻譯的“無效”RNA片段被稱為內(nèi)含子，而可以被核糖體翻譯的RNA片段叫做外顯子，內(nèi)含子被去除、外顯子被連接這一過程即為RNA剪接。RNA剪接普遍存在于真核生物中，隨著物種的進化，含有內(nèi)含子的基因數(shù)量增加，發(fā)生RNA剪接的頻率也相應增高，使得一個基因編碼多個蛋白質(zhì)成為可能，極大的豐富了蛋白質(zhì)組的多樣性，也是真核生物多樣性的重要原因之一。RNA剪接是真核生物基因表達調(diào)控的重要環(huán)節(jié)之一，其化學本質(zhì)是兩步轉酯反應。這種看似簡單的化學反應在細胞中難以自行發(fā)生，而負責執(zhí)行這一化學反應的是細胞核內(nèi)一個巨大且高度動態(tài)變化的分子機器——剪接體（spliceosome）。從1977年首次發(fā)現(xiàn)RNA剪接至本世紀初，科學家們通過免疫沉淀、基因敲除、交聯(lián)質(zhì)譜、建立體外剪接反應系統(tǒng)等研究手段，初步建立起剪接體的組裝、激活與解聚的發(fā)生過程，以及蛋白與蛋白、蛋白與核酸之間的相互作用、相互調(diào)控等復雜的RNA剪接調(diào)控網(wǎng)絡。在RNA剪接反應過程中，多種蛋白-核酸復合物及剪接因子按照高度精確的順序發(fā)生結合、重排和解聚，依次形成預組裝復合物U4/U6.U5 tri-snRNP（U4/U6.U5三小核核糖核蛋白復合物）以及至少10個狀態(tài)的剪接體E、A、pre-B、B、Bact、B*、C、C*、P以及ILS復合物。剪接體每種狀態(tài)的轉變，都需要動力驅動蛋白——ATPase/helicase對剪接體的結構重塑進行嚴格的調(diào)控（圖2），它們在催化剪接體構象的改變、控制RNA剪接的進程、對RNA進行檢驗和校對等過程中有著極其關鍵的作用，被譽為RNA剪接的“分子時鐘”。
圖2 ?RNA剪接示意圖（圖片來源:?Yan, C., Wan, R., & Shi, Y. (2019).
Cold Spring Harbor perspectives in biology, 11(1), a032409.）
由于剪接體高度的動態(tài)性和復雜性，獲得不同狀態(tài)的剪接體的高分辨率三維結構被公認為世界難題。在這種巨大的挑戰(zhàn)下，施一公教授率領研究組迎難而上，經(jīng)過7年的努力，終于在2015年在全世界首次報道了裂殖酵母剪接體3.6埃的高分辨率結構，首次展示了剪接體催化中心近原子分辨率的結構。這一重大研究成果對RNA剪接機理的研究產(chǎn)生革命性影響。自2015年第一個剪接體結構發(fā)表以后，施一公研究組相繼解析了釀酒酵母剪接體復合物全部已被鑒定的9個不同狀態(tài)的高分辨率結構，分別是3.8埃的預組裝復合物U4/U6.U5 Tri-snRNP、3.3埃-4.6埃的預催化剪接體前體pre-B complex、3.9埃的預催化剪接體B complex、3.5埃的激活狀態(tài)剪接體Bact complex、2.9埃-3.8埃的催化激活剪接體B* complex、3.4埃的第一步催化反應后剪接體C complex、4.0埃的第二步催化激活剪接體C* complex、3.6埃的完成兩步轉酯反應后的剪接體P complex，以及3.5埃的內(nèi)含子套索剪接體ILS complex的結構。這些已解析的剪接體覆蓋了RNA剪接循環(huán)，從分子層面揭示了剪接體催化RNA剪接兩步反應的工作機理，同時為理解剪接體的組裝、激活和解聚等過程的發(fā)生提供結構依據(jù)。然而，在每種狀態(tài)的剪接體結構中，“動力源”蛋白ATPase/helicase均處于剪接體的邊緣，它們的構象極不穩(wěn)定，因此無法揭示“分子時鐘”精確的原子模型。如何闡述剪接體重塑蛋白控制剪接體狀態(tài)轉變的分子機理，一直是領域內(nèi)的核心難題之一。在最新發(fā)表的這篇《科學》文章中，施一公研究組以激活剪接體的結構重塑蛋白Prp2為切入點，巧妙地設計了Prp2的突變體，使其失去結合ATP的功能，成功的將RNA剪接阻斷并富集了大量的激活狀態(tài)剪接體Bact complex；失活的Prp2也更加穩(wěn)定地結合在剪接體上，從而最終獲得了構象穩(wěn)定、性質(zhì)良好的Bact complex樣品。隨后利用單顆粒冷凍電鏡技術重構出了整體分辨率為2.5埃的Bact complex冷凍電鏡結構，其中，處于剪接體邊緣的結構重塑蛋白ATPase/helicase Prp2與其激活因子Spp2的分辨率高達3.2埃，并搭建了原子模型（圖3）。
圖1 ?施一公研究組最新圖3 釀酒酵母激活剪接體及結構重塑蛋白Prp2的三維結構
《科學》長文
在如此高的分辨率下，該文解析的Bact complex結構首次觀察到了剪接體核心區(qū)域中的水分子通過氫鍵參與關鍵剪接位點的識別、以及與金屬離子的配位結合。令人驚喜的是，該結構展示了激活因子Spp2通過四個關鍵的錨定位點，將Prp2固定到剪接體上。Spp2對于Prp2激活剪接體、催化剪接體結構重塑的重要作用也被基于結構設計的大量生化實驗驗證。本文另一亮點是通過分析Prp2結合前體信使RNA的相互作用界面，并結合體外剪接反應等生化實驗、以及所解析的3個不同狀態(tài)的Prp2電鏡結構，第一次揭示了Prp2作為ATPase/helicase在單鏈RNA上單向移動的分子機理。其中，兩個關鍵的氨基酸L536和R844在阻止RNA反向滑動中起到了至關重要的作用，保證Prp2在前體信使RNA上由3’向5’方向移動，從而將分支點區(qū)域的蛋白復合物從剪接體上解離下來，促使剪接體發(fā)生結構重塑進而發(fā)生第一步剪接反應（圖4）。圖4 結構重塑蛋白Prp2及其激活因子Spp2的三維結構此前，施一公研究組解析了已被鑒定的酵母中全部狀態(tài)的剪接體高分辨三維結構，而本文作為第一篇剪接體重塑機制的結構研究，首次揭示了位于剪接體原位的ATPase/helicase高分辨率的三維結構，為理解剪接體激活重塑的分子機理提供了迄今最清晰的結構信息。施一公教授、萬蕊雪博士為本文的共同通訊作者；西湖大學生命科學學院博士后白蕊、西湖學者萬蕊雪和清華大學結構生物學高精尖創(chuàng)新中心助理教授閆創(chuàng)業(yè)為該文的共同第一作者，清華大學生命學院博士生賈麒參與了部分生化實驗；清華大學冷凍電鏡平臺主管雷建林博士為冷凍電鏡數(shù)據(jù)收集提供了幫助。電鏡數(shù)據(jù)采集于清華大學冷凍電鏡平臺，計算工作得到清華大學高性能計算平臺、國家蛋白質(zhì)設施實驗技術中心（北京）的支持。本工作獲得了西湖教育基金會、北京結構生物學高精尖創(chuàng)新中心（清華）及國家自然科學基金委的經(jīng)費支持。
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