外泌體miRNA測序：如何搞定10分的miRNA標(biāo)志物Paper？
圖1. Biomarker發(fā)現(xiàn)策略示意圖肺癌仍然是中美兩國男性和女性癌癥死亡的主要原因。晚期診斷是改善肺癌預(yù)后的主要障礙。miRNAs在肺癌的診斷和預(yù)后中得到了廣泛的研究。但利用外周血確定早期NSCLC診斷中腺癌和SCC特異性miRNA表達譜的研究卻很少。另外，體液外泌體miRNAs的鑒定證明了其在NSCLC的臨床診斷和預(yù)后方面的潛在應(yīng)用價值。然而，血漿中腫瘤細胞來源的外泌體miRNAs能否提示早期NSCLC診斷尚不清楚。本研究的目的是鑒定腫瘤來源的外泌體生物標(biāo)志物，能夠作為一種無創(chuàng)方法在早期診斷中區(qū)分腺癌和SCC，從而在早期階段提高NSCLC診斷的特異性和敏感性。圖2. 外泌體miRNA生物標(biāo)志物研究思路提取健康對照、AC和SCC患者總的和腫瘤來源外泌體，并通過Western blot和紅外成像系統(tǒng)對外泌體進行鑒定和分析。2. 鑒定健康志愿者與腺癌和SCC患者腫瘤來源外泌體中與血漿總外泌體相關(guān)的miRNAs (Testing set)研究人員采用miRNA-seq鑒定了能夠區(qū)分健康組與腺癌組和SCC組的miRNAs。并通過進一步的分析，選取了腺癌患者中20個上調(diào)和31個下調(diào)的miRNAs，SCC患者中15個上調(diào)和20個下調(diào)的miRNAs，進行下一階段實驗。圖4. 通過miRNA-seq數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析鑒定腺癌（AC）和SCC特異性miRNAs3. 定量PCR驗證miRNA-seq數(shù)據(jù)基于qPCR的方法對總外泌體和腫瘤來源外泌體（TME）進行評估，鑒定了27個最顯著的腺癌和SCC特異性miRNAs。發(fā)現(xiàn)與健康組相比，腺癌患者中有11個miRNAs顯著高表達，13個miRNAs表達水平較低；SCC患者中有6個miRNAs顯著高表達，8個miRNAs表達水平較低。隨后，選取四個先前已報道為NSCLC生物標(biāo)志物并在腺癌和SCC腫瘤來源的外泌體樣品中表達的miRNAs（let-7b-5p、let-7e-5p、miR-24-3p和miR-486-5p）進行驗證。qPCR實驗數(shù)據(jù)驗證了miRNA-seq表達譜的可靠性。并且發(fā)現(xiàn)miR-181-5p、miR-30a-3p、miR-30e-3p和miR-361-5p是腺癌特異性，miR-10b-5p、miR-15b-5p和miR-320b是SCC特異性。4. 循環(huán)血漿和腫瘤來源外泌體之間差異miRNA表達（Validation set）研究發(fā)現(xiàn)miRNA在超離心后沉積物和外泌體缺失的血漿上清液之間存在明顯的表達差異。與外泌體缺失的血漿相比，let-7b-5p和miR-486-5p（可區(qū)分NSCLC患者和健康個體）在外泌體中的表達豐富。腺癌特異性miR-181b-5p和SCC特異性miR-320b也富集在外泌體中。另外，發(fā)現(xiàn)let-7b-5p、miR-23a-3p和let-7e-5p在組織和循環(huán)外泌體之間密切相關(guān)。圖6. 腫瘤來源外泌體miRNA和循環(huán)血漿miRNA相關(guān)性5. 外泌體miRNA panels作為診斷生物標(biāo)志物的診斷準(zhǔn)確性，用于檢測早期腺癌和SCC患者（Symptomatic set）為了評估m(xù)iRNA-seq譜數(shù)據(jù)對NSCLC的早期診斷價值，選擇let-7b-5p、let-7e-5p、miR-23a-3p和miR-486-5p，并使用qPCR測量了60個受試者標(biāo)準(zhǔn)化的Ct值，鑒定出43個NSCLC患者。通過測量miR-181b-5p和miR-361b-5p以及miR-10b-5p和miR-320b的組合Ct值，進一步鑒定出43名NSCLC患者中分別有31名腺癌患者和11名SCC患者。圖7. AC和SCC特異性腫瘤來源外泌體miRNA的早期診斷準(zhǔn)確性評估策略此外，用于NSCLC診斷的4個miRNAs在區(qū)分NSCLC患者和非NSCLC患者中的AUC值為0.899，靈敏度為80.25％，特異性為92.31％。用于腺癌診斷的兩個miRNAs（miR-181-5p和miR-361-5p）在區(qū)分腺癌患者和NSCLC患者的AUC值為0.936，靈敏度為80.65％，特異性為91.67％。用于SCC診斷的兩個miRNAs（miR-320b和miR-10b-5p）在區(qū)分SCC患者和NSCLC患者的AUC值為0.911，靈敏度為83.33％，特異性為90.32％。3個miRNA panels可作為NSCLC的主要診斷生物標(biāo)志物。通過將腺癌或SCC特異性miRNAs納入診斷，可以通過進一步的病理診斷來改善預(yù)后。參考文獻：Jin X, Chen Y, Chen H, et al. Evaluation of Tumor-Derived Exosomal miRNA as Potential Diagnostic Biomarkers for Early-Stage Non–Small Cell Lung Cancer Using Next-Generation Sequencing[J].?Clinical Cancer Research, 2017, 23(17): 5311-5319.來源：銳博生物
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