cGAS-STING通路是負責識別胞質DNA免疫應答的主要通路¹。cGAS作為胞質DNA受體，可以被DNA和/或Mn²⁺激活并利用ATP和GTP合成第二信使2’3′-cGAMP，后者進一步激活STING并誘導I型干擾素等細胞因子的產生，從而介導抗感染/腫瘤免疫反應。研究表明，多種病原微生物入侵及各種壓力脅迫，如氧化應激、代謝紊亂及DNA損傷等都可導致胞質DNA的累積及Mn²⁺濃度的升高，從而激活cGAS-STING通路。因此，cGAS-STING信號通路在抵抗病原微生物感染、腫瘤及多種免疫相關疾病的發(fā)生及治療中都發(fā)揮關鍵作用。

磷脂酰肌醇磷酸（phosphoinositides，PIPs）是構成真核生物細胞膜組分的重要磷脂（占總磷脂的5—10%），也是重要的信號分子²。由于肌醇六元環(huán)上D-3、D-4或D-5位都可發(fā)生磷酸化修飾，因此真核生物中總共存在7種不同PIP分子。PI4P（phosphatydyinositol 4-phosphate）是胞內含量最高的PIP分子，廣泛分布于各種膜組分，且在反式高爾基體（trans-Golgi network，TGN）上的含量最高。細胞中的PI4P的含量主要受其合成酶PI4Ks（PI4KA、PI4KB、PI4K2A和PI4K2B）和降解酶SAC1的調控。PI4P不僅是合成PIP2和PIP3的前體，也是重要的信號分子，在膜泡運輸、脂質轉運和細胞器形態(tài)維持等方面發(fā)揮關鍵作用。

2021年，北京大學生命科學學院/北大-清華生命科學聯(lián)合中心的蔣爭凡教授實驗室利用STING自激活突變體誘導細胞死亡的特性，在HT080細胞中進行了基于CRISPR-Cas9介導的全基因組篩選，發(fā)現(xiàn)高爾基體腔內合成的硫酸化糖胺聚糖（sGAGs）可以通過結合到STING跨膜區(qū)的腔內側，從而誘導STING的寡聚及激活³。該論文的討論部分提到STING和sGAGs的相互作用受到STING腔內側pH值的調控，并由此推測STING在pH更低的后高爾基體囊泡（post-Golgivesicles）中會有更高的活性。但是在這項研究中，他們沒有解釋STING為什么需要及如何轉運到后高爾基體囊泡。

2023年3月14日，蔣爭凡實驗室在Immunity上以research article形式在線發(fā)表了題為“ARMH3-mediated recruitment of PI4KB directs Golgi-to-endosome trafficking and activation of the antiviral effector STING”的論文，報道了ARMH3作為接頭蛋白招募PI4KB到STING，PI4KB通過合成PI4P促進STING從高爾基體到內體的轉運（Golgi-to-endosome trafficking）及維持STING激活所需要的脂膜環(huán)境（lipiden vironment），從而幫助STING更加穩(wěn)定高效地激活。

本工作首先通過CRISPR-Cas9介導的全基因組篩選在HeLa細胞系中鑒定到一個未知功能的新基因C10ORF76（又名ARMH3）對STING的激活十分重要（圖一A）。ARMH3是一個鮮少被研究的蛋白，為數(shù)不多的幾篇文章暗示了它對于PI4KB發(fā)揮激酶活性來磷酸化磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）生成PI4P十分重要。免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)STING激活后和ARMH3、PI4KB及PI4P都在反式高爾基體有明顯的共定位。進一步免疫共沉淀實驗顯示，STING只有在ARMH3存在的情況下和PI4KB有互作（圖一B），表明ARMH3在STING和PI4KB之間起到橋梁作用。進一步實驗表明，ARMH3分別結合位于STING第二、三跨膜區(qū)之間的連接區(qū)域及位于PI4KB激酶結構域中間的連接區(qū)域。突變掉STING負責結合ARMH3的氨基酸或者利用CRISPR-Cas9原位刪除PI4KB與ARMH3互作的關鍵區(qū)域（6個氨基酸殘基）都會顯著削弱cGAS-STING通路的激活。這些結果表明，ARMH3招募PI4KB對于STING的激活十分關鍵。更重要的是，細胞內敲除ARMH3或者原位刪除PI4KB結合ARMH3所需的6個氨基酸，STING在上游通路活化后幾乎呈現(xiàn)完全的內質網定位，暗示如果2’3′-cGAMP結合后被轉運到高爾基體的STING無法被繼續(xù)轉運到后高爾基體囊泡，將會被細胞內COPI/AP1介導的從高爾基體向內質網的逆向轉運運回內質網，并完全抑制STING的活化。

為了更直接地研究PI4KB對STING激活的影響，研究者使用雷帕霉素誘導的FKBP和FRB相互作用，直接招募PI4KB-GFP-FKBP到STING-mCherry-FRB，并發(fā)現(xiàn)招募PI4KB到STING會顯著促進STING聚集體的形成及下游信號通路的激活（圖一C），且這種對于STING通路的激活能力完全依賴于PI4KB的激酶活性。相反，招募PI4P的磷酸酶SAC1到STING則會抑制STING聚集體的形成及下游信號通路的激活。表明PI4KB通過在STING周圍合成PI4P促進STING的激活。有趣的是，SAC1的敲低會引起細胞內PI4P水平的異常升高，進而導致STING不依賴于cGAS的自激活。TMEM39A是一個自身免疫性疾病相關基因且被報道參與細胞內的PI4P水平的調控⁴。同樣，TMEM39A的敲低也會導致細胞內PI4P的水平的異常升高及STING的自激活，該發(fā)現(xiàn)有助于理解TMEM39A相關自身免疫疾病的致病機制。此外，SCAP 和NPC1的突變也被報道可以引起細胞內PI4P的水平的異常升高及STING的自激活^5—8，提示胞內PI4P水平的異常升高可能是這些基因突變導致STING自激活的共同原因。

為了研究PI4P如何影響STING的激活，研究者對23個PI4P結合蛋白進行了系統(tǒng)性的敲低并發(fā)現(xiàn)其中9個成員的降低表達會使STING的激活嚴重受損（圖一D）。功能分析表明，這9個PI4P結合蛋白可以分為兩類。其中AP-1和GGA2負責介導高爾基體到內體的膜泡運輸。由于內體中相對更低的pH值有利于STING與sGAGs的結合，他們推測PI4P可以通過指導AP-1和GGA2介導的clathrin-coated vesicles (CCVs)將STING從高爾基體轉運到內體從而避免STING被運回內質網，并且更加強烈激活STING。另一類PI4P結合蛋白均為脂質轉運蛋白，其中OSBP和ORPs負責從內質網向高爾基體或內體轉運膽固醇，CERT負責神經酰胺從內質網到高爾基體的轉運。神經酰胺在高爾基體上會在SGSM1的催化下轉化為鞘磷脂，且SGSM1在細胞內的敲除會顯著削弱STING的激活，提示鞘磷脂而非神經酰胺直接作用于STING。通過特異的化學小分子破壞膽固醇和鞘磷脂在脂膜上的分布會使STING聚集體逐漸消散并顯著抑制STING下游信號通路的激活，表明膽固醇和鞘磷脂對STING聚集體的形成和激活十分關鍵。以上結果共同表明，PI4P還可以通過脂質轉運蛋白維持STING活化所需的脂膜環(huán)境進而影響STING的激活。此外，Lyz-Cre介導的Armh3條件敲除小鼠實驗表明Armh3在機體對抗DNA病毒感染過程中發(fā)揮關鍵作用。

綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)：1）STING為什么需要離開及如何離開高爾基體【后高爾基體轉運（post-Golgi trafficking）】的分子機制（圖二）；2）一個功能未知蛋白ARMH3（可能還具有GEF活性，激活膜泡轉運中非常重要的Small GTPase Arf1）在cGAS-STING通路中的重要作用；3）脂膜環(huán)境對STING的活化十分關鍵；4）細胞內PI4P水平的異常升高可以導致非依賴于cGAS的STING分子自激活（cGAS-independent STING autoactivation）。重要的是，這種現(xiàn)象在很多脂質代謝紊亂的自身免疫病患者中被發(fā)現(xiàn)及報道。鑒于PI4P在脂質運輸及脂質穩(wěn)態(tài)維持中的核心作用，該研究還提示，STING作為一個潛在的細胞脂質穩(wěn)態(tài)感受器（lipid homeostasis sensor），可能是細胞內的一種新型危險信號感受器。

北京大學生科院博士后方潤和蔣啟飛為該文章的共同第一作者，2022級研究生賈新穎也為本研究作出貢獻。蔣爭凡為通訊作者。本研究工作得到了國家自然科學基金委、科技部國家重點基礎研究項目、北京大學“細胞增殖與分化”教育部重點實驗室及北大-清華生命科學聯(lián)合中心的資助。

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3. Fang, R. et al. Golgi apparatus-synthesized sulfated glycosaminoglycans mediate polymerization and activation of the cGAMP sensor STING. Immunity?54, 962—975, doi:10.1016/j.immuni.2021.03.011 (2021).

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來源：北京大學