浙大校友揭示DNA損傷又一機(jī)制，自學(xué)Python實(shí)現(xiàn)追蹤DNA復(fù)制“許可”動(dòng)態(tài)，為抗腫瘤藥物研發(fā)提供新思路
“新冠疫情造成了研究遲緩。不過(guò)在那段時(shí)間，我有大量的 Bench-free Time，自學(xué)了 Python 語(yǔ)言，后來(lái)已經(jīng)可以獨(dú)立寫(xiě)代碼分析數(shù)據(jù)，這反而加速了后來(lái)的研究，也算是彌補(bǔ)了因疫情導(dǎo)致的延緩?！彪m然是藥理學(xué)博士，但浙大校友梅柳竟然自己學(xué)會(huì)了計(jì)算機(jī)編程語(yǔ)言 Python。
Python 也助力她發(fā)表了一篇頂刊論文，完成發(fā)論文這件大事之后，33 歲的梅柳即將迎來(lái)另一件大事——成為一名媽媽。
圖 | 梅柳（來(lái)源：梅柳）
在半個(gè)月前發(fā)表的論文中，利用首創(chuàng)的分析 MCM 加載動(dòng)態(tài)的方法，她和團(tuán)隊(duì)首次將活細(xì)胞成像技術(shù)與固定細(xì)胞免疫熒光成像技術(shù)，聯(lián)合用于檢測(cè)單細(xì)胞水平 MCM 復(fù)合體在人類(lèi)亞細(xì)胞核內(nèi)的加載動(dòng)態(tài)，填補(bǔ)了該復(fù)合體在不同染色質(zhì)環(huán)境的加載動(dòng)態(tài)研究的空白。其中，MCM 的全稱(chēng)是 Minichromosome Maintenance Protein Complex，指的是微染色體維持蛋白復(fù)合體。
1 月 26 日，相關(guān)論文以《在不同染色質(zhì)環(huán)境中起源許可動(dòng)態(tài)差異的后果》（The consequences of differential origin licensing dynamics in distinct chromatin environments）為題，發(fā)表在 Nucleic Acids Research（IF 16.971）上[1]。目前，梅柳在北卡羅萊納大學(xué)教堂山分校生物化學(xué)與生物物理系做博后研究，是此次論文的第一作者。
圖 | 相關(guān)論文（來(lái)源：Nucleic Acids Research）
細(xì)胞周期第一階段的晚期，對(duì)異染色質(zhì) MCM 加載極為重要
一般來(lái)講，細(xì)胞在每次分裂之前都要完成 DNA 復(fù)制，以確保分裂之后每個(gè)后代細(xì)胞仍然含有與母細(xì)胞數(shù)量相同的 DNA，只有這樣才能保證遺傳穩(wěn)定性。
但在 DNA 復(fù)制之前，細(xì)胞得先給部分 DNA 發(fā)放復(fù)制“起源許可”，這樣一來(lái) DNA 只能在獲得許可的位置開(kāi)啟復(fù)制。DNA 復(fù)制許可（DNA Replication Licensing）假說(shuō)認(rèn)為，染色質(zhì) DNA 在細(xì)胞分裂發(fā)生之前精確復(fù)制、且僅復(fù)制一次的過(guò)程中，“起源許可”的作用至關(guān)重要。
細(xì)胞內(nèi)所有 DNA 都必須被復(fù)制，無(wú)論是處于致密的異染色質(zhì)環(huán)境，還是處于疏松的常染色質(zhì)環(huán)境。這意味著在有限的 DNA 復(fù)制準(zhǔn)備時(shí)間內(nèi)，也就是在 G1 期之內(nèi)（G1 phase，一個(gè)細(xì)胞周期的第一階段），所有 DNA 都要獲得合適的起源許可。
已有研究發(fā)現(xiàn)，起源許可數(shù)量不足、或分布不均，都會(huì)導(dǎo)致染色體遺傳的不穩(wěn)定。對(duì)于“起源許可”的生化過(guò)程、即 MCM 復(fù)合體的 DNA 加載來(lái)說(shuō)，此前已有大量詳實(shí)報(bào)道。
（來(lái)源：Nucleic Acids Research）
但是，關(guān)于這一過(guò)程本身對(duì)于染色質(zhì)環(huán)境是否具有偏好性、或優(yōu)先級(jí)的研究，目前尚未報(bào)道。
而在該研究中，梅柳通過(guò)向人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞導(dǎo)入帶有不同熒光的細(xì)胞周期追蹤蛋白，并使用活細(xì)胞成像記錄細(xì)胞的生長(zhǎng)周期。
在活細(xì)胞成像結(jié)束后，梅柳又通過(guò)特殊試劑去除游離的 MCM 并固定細(xì)胞，隨后進(jìn)行 MCM 以及染色質(zhì)標(biāo)簽的免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)，并通過(guò)高分辨率共聚焦顯微鏡、對(duì)單個(gè)不同時(shí)期的 G1 期細(xì)胞進(jìn)行多層次 3D 成像。
這時(shí)根據(jù)活細(xì)胞成像記錄，即可知曉每個(gè)細(xì)胞的分裂史、以及所處時(shí)期；而根據(jù)固定細(xì)胞免疫熒光成像，則可獲得 MCM 復(fù)合體的亞細(xì)胞核加載的數(shù)量。
綜合兩者得到的信息，即可繪制出 MCM 在不同 DNA 復(fù)制準(zhǔn)備時(shí)期、以及不同染色質(zhì)區(qū)域的加載量，從而得到 MCM 的加載動(dòng)態(tài)。
基于以上方法，梅柳發(fā)現(xiàn)在 G1 早期異染色質(zhì)加載 MCM 復(fù)合體的速率低于常染色質(zhì)，然而在 G1 晚期異染色質(zhì)與常染色加載 MCM 速率相當(dāng)。
（來(lái)源：Nucleic Acids Research）
基于此現(xiàn)象她推測(cè)，相比常染色質(zhì)來(lái)說(shuō)，G1 晚期對(duì)于異染色質(zhì)加載足量 MCM 更重要。為驗(yàn)證這一假設(shè)，梅柳通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)胞周期蛋白 cyclin E 從而縮短 G1 期長(zhǎng)度，迫使細(xì)胞過(guò)早進(jìn)入 DNA 復(fù)制期也就是 S 期（S phase，即 DNA 合成期）。
在這些具有極短 G1 期的細(xì)胞中，其 G1 晚期異染色質(zhì) MCM 加載不足的現(xiàn)象顯著高于常染色質(zhì)。在隨后的 G2 期，這些具有極短 G1 期的細(xì)胞核內(nèi)異染色質(zhì)的 DNA 損傷程度，明顯高于正常細(xì)胞。而在兩組細(xì)胞中，常染色質(zhì)的 DNA 損傷則無(wú)明顯差異。
進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致常染色質(zhì)和異染色質(zhì) MCM 加載動(dòng)態(tài)的差異，部分源于 ORCA 蛋白在常染色質(zhì)和異染色質(zhì)在 G1 不同時(shí)期的分布差異，進(jìn)而導(dǎo)致了所招募的 ORC 的分布差異。
梅柳表示：“我們的研究首次發(fā)現(xiàn)：相較于常染色質(zhì)，異染色質(zhì)許可在 G1 期相對(duì)延后，這意味 G1 晚期對(duì)于異染色質(zhì) MCM 加載極為重要。而這一特殊的許可動(dòng)態(tài)，決定了在 G1 期異?？s短的細(xì)胞中比如原癌基因激活或抑癌基因丟失的細(xì)胞，異染色質(zhì)極易因?yàn)樵馐茉S可不足，而導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性增加。因此，完整的 G1 期對(duì)于維持基因組的穩(wěn)定性極其重要?！?/p>
（來(lái)源：Nucleic Acids Research）
回顧研究步驟，她表示首先是提出立題依據(jù)，其所在實(shí)驗(yàn)室對(duì)于“起源許可”的研究經(jīng)驗(yàn)比較豐富，此前該實(shí)驗(yàn)室的博士生雅各布·馬特森（Jacob Matson）發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞的“起源許可”速度明顯快于已分化細(xì)胞。
相比分化細(xì)胞，干細(xì)胞的染色質(zhì)環(huán)境通常更為疏松。這些背景促使梅柳和團(tuán)隊(duì)提出如下研究假設(shè)：疏松的常染色質(zhì)和致密的易染色質(zhì)，是否也在“起源許可”過(guò)程中存在差異？如果存在差異，那么對(duì)細(xì)胞有怎樣的意義？其中的分子機(jī)制又是如何？
有了假設(shè)，就要建立實(shí)驗(yàn)方法，這一過(guò)程非常耗時(shí)。因?yàn)榧?xì)胞中的 MCM 大部分游離于細(xì)胞中，只有一部分 MCM 會(huì)加載到 DNA 上，且加載過(guò)程是單向不可逆的，而目前并沒(méi)有任何可用的實(shí)時(shí) MCM 加載追蹤標(biāo)記物。
為了研究 MCM 加載動(dòng)態(tài)，梅柳不得不先依靠活細(xì)胞成像技術(shù)，去獲取大量單個(gè)細(xì)胞的“分子年齡”，并通過(guò)免疫熒光染色及共聚焦 3D 成像，進(jìn)一步測(cè)量單個(gè)細(xì)胞 MCM 加載情況，以根據(jù)這些信息繪制出 MCM 在不同亞細(xì)胞核內(nèi)的加載動(dòng)態(tài)。
同時(shí)，大量單細(xì)胞成像的數(shù)據(jù)分析也十分復(fù)雜，梅柳的合作伙伴通過(guò)各種調(diào)試，開(kāi)發(fā)出一系列 Python 源代碼，這時(shí)終于實(shí)現(xiàn)了在不同染色質(zhì)環(huán)境內(nèi)，對(duì)批量單細(xì)胞 MCM 的定量分析。
（來(lái)源：Nucleic Acids Research）
接下來(lái)，便是實(shí)驗(yàn)實(shí)施和結(jié)論得出的階段。
期間，梅柳對(duì)比了 MCM 在常染色質(zhì)和異染色質(zhì)的加載動(dòng)態(tài)，發(fā)現(xiàn) MCM 在異染色質(zhì)的加載過(guò)程相對(duì)延后，但是最終進(jìn)入 DNA 復(fù)制期時(shí)，單位含量 DNA 的 MCM 加載數(shù)量相當(dāng)。
進(jìn)一步研究后，她發(fā)現(xiàn)如果人為縮短 G1 期，會(huì)導(dǎo)致異染色質(zhì)的 DNA 損傷，不過(guò)并不會(huì)對(duì)常染色質(zhì)產(chǎn)生影響。這說(shuō)明，對(duì)于維持基因組的穩(wěn)定性來(lái)說(shuō)，合適長(zhǎng)度的 G1 期的極其重要。此外，梅柳還發(fā)現(xiàn)了 MCM 在常染色質(zhì)和異染色質(zhì)加載差異的分子機(jī)制。
（來(lái)源：Nucleic Acids Research）
疫情導(dǎo)致研究延遲，“被迫”學(xué)會(huì) Python 編程
概括來(lái)說(shuō)，此次研究揭示了縮短 G1 期可導(dǎo)致 DNA 的損傷的其中一個(gè)原因。如果開(kāi)發(fā)出可以明顯縮短 G1 期的藥物、并用于 G1 期較長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞，就能損傷腫瘤細(xì)胞的 DNA，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。
“也就是說(shuō)，我們?yōu)閷?lái)抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了一種新的角度和理論依據(jù)。”梅柳表示。
同時(shí)，她也坦言研究遇到了許多挑戰(zhàn)，尤其首創(chuàng)的追蹤 MCM 加載動(dòng)態(tài)的方法。期間嘗試了許多方法，才優(yōu)化出最好的方法。
其中一個(gè)挑戰(zhàn)是活細(xì)胞成像在普通熒光顯微鏡下完成，而固定染色后的細(xì)胞最終成像要在另一臺(tái)共聚焦顯微鏡下完成。
她遇到的難題之一是如何在共聚焦顯微鏡下找到活細(xì)胞成像時(shí)記錄的細(xì)胞，為此梅柳最開(kāi)始應(yīng)用了底部帶有網(wǎng)格標(biāo)記的培養(yǎng)皿，每次都能根據(jù)網(wǎng)格位置找到目的細(xì)胞群，但是這種培養(yǎng)皿價(jià)格昂貴且只能做一組實(shí)驗(yàn)。
經(jīng)過(guò)與該校顯微鏡中心專(zhuān)業(yè)人士的多次討論，最終決定使用普通活細(xì)胞成像的培養(yǎng)板，但是需要人為在板底標(biāo)記一個(gè)特殊位置，并設(shè)置該位點(diǎn)的坐標(biāo)軸為（0，0），這意味著其他成像位點(diǎn)相對(duì)于該標(biāo)記也有了自己的相對(duì)坐標(biāo)。如此一來(lái)，無(wú)論將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移到任何顯微鏡下，都可根據(jù)這些坐標(biāo)找到初始成像位點(diǎn)。
對(duì)于后續(xù)計(jì)劃，她表示該研究的實(shí)驗(yàn)手段仍有改進(jìn)空間。接下來(lái)可能會(huì)在檢測(cè)手段上進(jìn)一步優(yōu)化，或采用完全不同的手段，比如利用 DNA 成像技術(shù)以便更精確地揭示不同染色質(zhì)環(huán)境下的 MCM 加載動(dòng)態(tài)。
（來(lái)源：Nucleic Acids Research）
“我是有回國(guó)打算的”
梅柳是黑龍江海林人，本科畢業(yè)于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)制藥工程專(zhuān)業(yè)；碩士畢業(yè)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)專(zhuān)業(yè)，師從楊寶峰院士，期間她主要研究心血管疾??；博士畢業(yè)于浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)專(zhuān)業(yè)，師從吳希美教授，博士期間以第一作者發(fā)表高質(zhì)量 SCI 論文兩篇（Cancer Letters, 2016; Oncogene, 2021）。
其表示：“我在博士期間的主要工作，在于首次鑒定了 Hippo 信號(hào)通路的關(guān)鍵激酶 LATS1 的 SUMO 化修飾，對(duì)于 LATS1 激酶活性的調(diào)控至關(guān)重要，并且發(fā)現(xiàn)這一修飾決定了 LATS1 的生物學(xué)功能的多樣性?！?/p>
在博士期間，梅柳曾多次獲得“優(yōu)秀研究生”稱(chēng)號(hào)并獲得國(guó)家獎(jiǎng)學(xué)金一次。目前，她在美國(guó)北卡羅萊納大學(xué)教堂山分校生物化學(xué)與生物物理系從事博士后研究，導(dǎo)師為簡(jiǎn)·庫(kù)克（Jean Cook）教授，研究方向?yàn)榧?xì)胞周期調(diào)控機(jī)制。
目前國(guó)內(nèi)對(duì)科研越來(lái)越重視，科研環(huán)境也越來(lái)越越好。對(duì)于博后出站后的安排，她說(shuō)：“我是有回國(guó)打算的，打算一邊找工作一邊把手上目前在研的課題做完。”
-End-
參考：
1、Mei, L., Kedziora, K. M., Song, E. A., Purvis, J. E., & Cook, J. G. (2022). The consequences of differential origin licensing dynamics in distinct chromatin environments.Nucleic Acids Res.
來(lái)源：麻省理工科技評(píng)論
本文系作者 @TIMEDOO 原創(chuàng)發(fā)布在 肽度TIMEDOO。未經(jīng)許可，禁止轉(zhuǎn)載。
