2023年12月22日,復(fù)旦上醫(yī)徐彥輝團(tuán)隊(duì)在《科學(xué)》(Science)雜志上在線發(fā)表題為“Structural visualization of transcription initiation in action”的研究長文(Research Article)。該項(xiàng)研究首次用結(jié)構(gòu)重現(xiàn)出了轉(zhuǎn)錄從頭起始的16個連續(xù)動態(tài)全過程,揭示了通用轉(zhuǎn)錄因子(GTFs)和轉(zhuǎn)錄泡協(xié)同RNA聚合酶Pol II調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始向轉(zhuǎn)錄延伸轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制。

第六篇Science,復(fù)旦上醫(yī)團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)描繪轉(zhuǎn)錄起始連續(xù)動態(tài)全過程-肽度TIMEDOO

一部58萬張照片的分子定格電影

生命的遺傳物質(zhì)是DNA,而DNA可以通過自我復(fù)制,伴隨著細(xì)胞的分裂傳遞遺傳信息。DNA可以通過轉(zhuǎn)錄形成RNA,RNA通過翻譯的過程合成蛋白質(zhì)。

轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)調(diào)控的核心,基因表達(dá)調(diào)控在人的發(fā)育、疾病發(fā)生過程中起到重要作用。真核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄需要經(jīng)歷起始,延伸,終止等多個階段。多細(xì)胞生物為了滿足在同一套基因組的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)差異性的基因表達(dá),需要經(jīng)過非常復(fù)雜且精細(xì)的基因表達(dá)調(diào)控過程?;虮磉_(dá)調(diào)控主要集中發(fā)生在轉(zhuǎn)錄的起始階段,細(xì)胞中基因的轉(zhuǎn)錄默認(rèn)是低活性狀態(tài),需要經(jīng)歷一系列復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄起始過程,才能起始基因表達(dá)。轉(zhuǎn)錄起始過程涉及十余個復(fù)合物上百個蛋白的巨大轉(zhuǎn)變,過去幾十年來,眾多的實(shí)驗(yàn)室利用生物化學(xué)、單分子生物物理以及結(jié)構(gòu)生物學(xué)等方法開展了大量探索性的工作,但對其發(fā)生過程和分子機(jī)制的理解還不夠深入。

第六篇Science,復(fù)旦上醫(yī)團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)描繪轉(zhuǎn)錄起始連續(xù)動態(tài)全過程-肽度TIMEDOO

轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控示意圖。黃色數(shù)字標(biāo)注是徐彥輝團(tuán)隊(duì)過去幾年來在轉(zhuǎn)錄起始方向取得的代表性成果。

在此項(xiàng)研究中,徐彥輝團(tuán)隊(duì)解析了一個轉(zhuǎn)錄過程中重要的動態(tài)事件:從轉(zhuǎn)錄起始向轉(zhuǎn)錄延伸的過渡,這一事件也被稱為啟動子逃逸。啟動子逃逸是轉(zhuǎn)錄從起始到延伸的關(guān)鍵轉(zhuǎn)折步驟,在這一過程中RNA聚合酶II的構(gòu)象需要發(fā)生變化,在生成RNA產(chǎn)物的同時解離通用轉(zhuǎn)錄因子。

長期以來,這一過程一直蒙著神秘面紗。中國科學(xué)院生物物理研究所研究員朱冰在專家點(diǎn)評中解讀,“這(揭示啟動子逃逸過程)是領(lǐng)域中一個長期未能解決的問題,因?yàn)檫@是一個快速的動態(tài)事件,RNA聚合酶II延伸的速度一般被認(rèn)為是每分鐘幾千個堿基,而啟動子逃逸過程涉及的大約只有最初的20個左右的堿基的合成,也就是說需要在幾秒鐘內(nèi)完成一系列的動態(tài)事件,這對于結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究是一個極大的挑戰(zhàn)?!?/p>

在研究過程中,徐彥輝團(tuán)隊(duì)致力于將這一瞬間定格為永恒。據(jù)介紹,研究人員設(shè)計(jì)了一系列的轉(zhuǎn)錄模板,可以控制RNA聚合酶II停在轉(zhuǎn)錄最初17個堿基時的任意一個堿基位置。這一設(shè)計(jì)好比讓連貫的場景變成一楨楨定格畫面,隨后,研究人員逐步捕捉每一步的畫面,連貫而成一部動態(tài)“電影”。這部“電影”也首次描繪出了連續(xù)的轉(zhuǎn)錄起始動態(tài)全過程,揭示完整轉(zhuǎn)錄起始過程及其分子機(jī)制。

由于復(fù)合物的組成和構(gòu)象不均一,為了獲得高分辨率結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù),研究人員利用復(fù)旦上醫(yī)平臺300 kV 冷凍電鏡采集了約110天,共58萬張照片數(shù)據(jù),獲得了分別暫停在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游2-17位核苷酸,核心分辨率為2.7-3.3 ?,共16個轉(zhuǎn)錄復(fù)合物(TC2-TC17)的結(jié)構(gòu)。通過這16個連續(xù)的結(jié)構(gòu),結(jié)合早期該團(tuán)隊(duì)解析的轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合物PIC結(jié)構(gòu),研究團(tuán)隊(duì)得以描繪這一動態(tài)全過程。

第六篇Science,復(fù)旦上醫(yī)團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)描繪轉(zhuǎn)錄起始連續(xù)動態(tài)全過程-肽度TIMEDOO

體外重建轉(zhuǎn)錄復(fù)合物體系。(A)16個(分別暫停在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游2-17位核苷酸的位置)的G-less DNA模板示意圖。(B)體外轉(zhuǎn)錄活性實(shí)驗(yàn)。(C)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物體外組裝示意圖。

第六篇Science,復(fù)旦上醫(yī)團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)描繪轉(zhuǎn)錄起始連續(xù)動態(tài)全過程-肽度TIMEDOO

解析的16個轉(zhuǎn)錄復(fù)合物結(jié)構(gòu)

通過動態(tài)全過程的描繪,研究團(tuán)隊(duì)首次觀測到啟動子逃逸的“關(guān)鍵一刻”正是當(dāng)RNA鏈由9個核苷酸(nucleotide,nt)增加到10 nt時,NTP水解驅(qū)動RNA-DNA移位并推動所累積的模板單鏈脹破由TFIIB和Pol II形成的模板鏈通道,導(dǎo)致TFIIB連帶其他GTF從Pol II上解離,轉(zhuǎn)錄泡“崩塌”(bubble collapse),轉(zhuǎn)錄復(fù)合物由ITC轉(zhuǎn)變成EEC狀態(tài),Pol II從啟動子逃逸(promoter escape)。

生命設(shè)計(jì)這一分子層面的“過河拆橋”,其邏輯在于:為了避免異常的基因表達(dá),真核基因默認(rèn)是沉默狀態(tài),Pol II本身無法打開啟動起始轉(zhuǎn)錄,為了起始轉(zhuǎn)錄,需要GTF幫助Pol II結(jié)合啟動子開始合成RNA,完成起始后當(dāng)RNA-Pol II-DNA足夠穩(wěn)定, Pol II要進(jìn)入延伸階段離開啟動子區(qū)域,需要擺脫GTF和啟動子的束縛。

“用最復(fù)雜的完整的復(fù)合物去開展研究”

過去幾十年來,關(guān)于轉(zhuǎn)錄起始研究達(dá)數(shù)百篇,但由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)材料的不一致,不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)論之間相互矛盾,許多結(jié)論長期以來未得到統(tǒng)一。

本研究將眾多看似矛盾的結(jié)論作了統(tǒng)一,回答了起始過程中眾多問題,揭示了轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控的機(jī)制,為理解基因表達(dá)調(diào)控奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。該研究也開創(chuàng)了利用生化和結(jié)構(gòu)生物學(xué)重構(gòu)生物大分子機(jī)器動態(tài)過程,揭示其工作機(jī)制的新路徑,為眾多復(fù)雜過程的研究提供了新思路。

此前,徐彥輝團(tuán)隊(duì)連續(xù)在Science雜志發(fā)表5篇研究論文,揭示多個轉(zhuǎn)錄起始關(guān)鍵過程的分子機(jī)制,包括揭示人源BAF復(fù)合物的染色質(zhì)重塑機(jī)制(點(diǎn)此閱讀)、轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物識別基因啟動子及其動態(tài)裝配機(jī)制(點(diǎn)此閱讀)、中介體促進(jìn)RNA聚合酶磷酸化和轉(zhuǎn)錄激活機(jī)制(點(diǎn)此閱讀)、+1核小體調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始的分子機(jī)制(點(diǎn)此閱讀)以及發(fā)現(xiàn)并鑒定新型轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物INTAC(點(diǎn)此閱讀)。上述工作較為系統(tǒng)地揭示了轉(zhuǎn)錄起始各個階段關(guān)鍵點(diǎn)的復(fù)合物狀態(tài),推動了對轉(zhuǎn)錄機(jī)制的深入理解。

“當(dāng)我們想進(jìn)入到這個領(lǐng)域的時候,我們也可以走簡單的路,但是我們希望從根本上去回答這個問題,用最復(fù)雜的完整的復(fù)合物去開展研究。”徐彥輝表示。“我們都是站在幾十年生化和結(jié)構(gòu)研究基礎(chǔ)上,才能得到現(xiàn)在的一些發(fā)現(xiàn)。當(dāng)然,給大家傳遞的信息是我們對于生命的分子事件的理解還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有達(dá)到真實(shí)的程度,還有很多未知的東西需要我們?nèi)ヌ剿??!蔽磥恚瑘F(tuán)隊(duì)將進(jìn)一步探索更多轉(zhuǎn)錄過程的圖景。

復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院青年研究員陳曦子、復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院2019級直博生劉維達(dá)、青年研究員王茜敏以及粵港澳大灣區(qū)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究院博士后王鑫鑫為本文共同第一作者,復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院研究員、生物醫(yī)學(xué)研究院兼職研究員徐彥輝為通訊作者。

原文鏈接:https://doi.org/10.1126/science.adi5120

來源:復(fù)旦大學(xué)官網(wǎng)